貧鈾暴露對(duì)腎臟和免疫系統(tǒng)的影響及鋅的解毒作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　貧鈾(depleteduranium,DU)是天然鈾經(jīng)過(guò)提煉濃縮鈾(235U)之后的剩余產(chǎn)物,其235U含量低于0.712％。由于DU具有良好的穿透性和原料的廉價(jià)性,被廣泛地用于核電站、平衡錘、輻射防護(hù)及軍事活動(dòng)中(如作為裝甲材料及彈藥成分)。在DU的生產(chǎn)和使用過(guò)程中,可能會(huì)不規(guī)范地釋放到環(huán)境中,經(jīng)呼吸道、消化道或皮膚進(jìn)入體內(nèi),對(duì)周圍居民的健康造成嚴(yán)重地威脅。
　　DU可發(fā)射高線性能量轉(zhuǎn)移的α、β粒子,

2、既具有放射毒性,又具有重金屬毒性,其生物學(xué)影響與接觸劑量、持續(xù)時(shí)間、接觸途徑等多種因素有關(guān)。在大劑量急性暴露的條件下,腎臟是鈾急性化學(xué)毒性的主要靶器官,可造成嚴(yán)重的腎近曲小管壞死,然而,DU引起腎臟毒性的準(zhǔn)確機(jī)制還不清楚。在低劑量慢性暴露的情況下,可能會(huì)引起一系列有害的效應(yīng),如神經(jīng)行為的異常、生殖毒性、遺傳毒性和癌癥等,然而,普遍關(guān)注的問(wèn)題——長(zhǎng)期攝入DU污染的食物對(duì)免疫系統(tǒng)的影響,目前還沒(méi)有報(bào)道。因此,本研究分別建立DU急性暴露模型和

3、經(jīng)過(guò)食入途徑的慢性暴露模型,分別評(píng)價(jià)急性DU暴露對(duì)腎臟的影響和慢性DU暴露對(duì)免疫系統(tǒng)的影響,深入探索急慢性DU暴露的作用機(jī)制,為DU生物學(xué)效應(yīng)的研究打下基礎(chǔ)。
　　此外,針對(duì)DU中毒的救治,仍是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。現(xiàn)有的DU促排藥在促排效果或安全性方面都或多或少存在問(wèn)題。金屬硫蛋白(metallothinein,MT)是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物器官和組織中的低分子量非酶蛋白,富含半胱氨酸,對(duì)重金屬離子有很高的親和力,并能清除多種

4、自由基,可實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬的解毒,但其解毒機(jī)制仍不完全清楚。MT基因的表達(dá),需要二價(jià)鋅離子的參與,鋅屬于高效且安全的MT誘導(dǎo)劑。因此,可試圖通過(guò)鋅誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生MT來(lái)實(shí)現(xiàn)DU的解毒治療,為臨床上開(kāi)發(fā)高效低毒的DU解毒藥物提供新的思路,具有重要的實(shí)用價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。
　　研究方法：
　　首先分別利用人腎臟近曲小管上皮HK-2細(xì)胞和成年SpragueDawley大鼠,暴露于不同劑量的DU,造成DU急性染毒模型,分別觀察暴露于DU后24h

5、對(duì)細(xì)胞存活率、凋亡及相關(guān)酶活力的影響,以及暴露于DU后4d對(duì)大鼠腎臟鈾含量、腎功能、組織病理學(xué)及腎臟組織抗氧化水平的影響。
　　其次,3周齡昆明系小鼠,按照喂食飼料(含DU)劑量的不同分為4組:0(對(duì)照組),3(DU3組),30(DU30組),和300(DU300組)mg/kg,喂食長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月,造成DU慢性染毒模型,評(píng)價(jià)小鼠天然免疫和獲得性免疫功能的變化。
　　最后,分別利用HK-2細(xì)胞、SpragueDawley大鼠和MT

6、基因敲除小鼠,進(jìn)行鋅對(duì)DU中毒的解毒作用及機(jī)制的研究,通過(guò)組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微病理學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、分子生物學(xué)及蛋白組學(xué)等技術(shù)方法多角度評(píng)價(jià)鋅對(duì)DU的解毒作用,深入探索鋅對(duì)DU的解毒機(jī)制。
　　研究結(jié)果及結(jié)論：
　　1.高于125μM的DU(硝酸鈾酰)暴露后24h,均可引起HK-2細(xì)胞質(zhì)膜和溶酶體膜的破壞,而導(dǎo)致乳酸脫氫酶(LDH)和N-乙酰-β-葡萄糖苷酶(NAG)從細(xì)胞

7、內(nèi)釋放到培養(yǎng)液中,最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。另外,將SpragueDawley大鼠急性暴露于不同劑量的DU(2.5、5、10mg/kg),4d后觀察發(fā)現(xiàn),大于2.5mg/kg的DU暴露劑量均可引起明顯的腎臟毒性,導(dǎo)致腎臟組織鈾含量、血清尿素(BUN)和肌酐(Cr)均明顯增高,組織病理學(xué)損傷嚴(yán)重,且隨著DU暴露劑量的增高損傷逐漸加重。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DU引起了腎臟組織氧化應(yīng)激,導(dǎo)致抗氧化能力下降,脂質(zhì)過(guò)氧化水平增高,可能是導(dǎo)致DU腎臟毒性的機(jī)制

8、之一。
　　2.3周齡小鼠喂食不同劑量的含DU飼料4個(gè)月后,各組血生化檢查均無(wú)明顯異常。在中劑量組(30mg/kg)和低劑量組(3mg/kg),免疫學(xué)影響并不明顯或影響相對(duì)輕微。但在高劑量組(300mg/kg),小鼠的天然免疫功能下降,表現(xiàn)為腹腔巨噬細(xì)胞分泌的NO、IL-1b、IL-18、TNF-α水平降低,脾臟自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercells,NKcells)的細(xì)胞毒性作用降低;小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能異常

9、,表現(xiàn)為脾臟T細(xì)胞增殖能力下降而B(niǎo)細(xì)胞的增殖能力提高,血清總IgG、IgE的含量增高,遲發(fā)性超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示足跖增厚程度下降;流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脾臟mIgM+mIgD+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例增高,CD3+細(xì)胞比例降低,CD4+/CD8+脾臟T細(xì)胞的比值降低;ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),脾細(xì)胞經(jīng)過(guò)刺激后,釋放IFN-γ和TNF-α的水平降低,而釋放IL-4和IL-10的水平卻增高。以上結(jié)果提示,造成高劑量組小鼠免疫功能障礙的原因主要與體內(nèi)輔助T細(xì)胞(Th

10、)1/Th2細(xì)胞因子平衡紊亂,引起機(jī)體各項(xiàng)免疫功能的調(diào)節(jié)失常有關(guān)。
　　3.線粒體調(diào)節(jié)的凋亡途徑和FasR調(diào)節(jié)的凋亡途徑共同參與了DU引起的HK-2細(xì)胞的凋亡過(guò)程。而100μM鋅預(yù)處理可明顯抑制DU(500μM)引起的HK-2凋亡,通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成,增加過(guò)氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量,抑制DU引起的sFasR和sFasL的過(guò)表達(dá),抑制線粒體中的細(xì)胞色素c和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)釋放到胞漿,抑制Cas

11、pases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活以及促進(jìn)了金屬硫蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),外源性金屬硫蛋白也具有很好的抗DU引起的凋亡的作用。本研究結(jié)果證實(shí)了,鋅通過(guò)一些獨(dú)立的機(jī)制抑制了DU引起的凋亡,包括抗氧化效應(yīng)、抑制Caspases-9、Caspases-8和Caspases-3的激活,并且金屬硫蛋白可能參與了鋅抗DU引起的凋亡過(guò)程。
　　4.鋅預(yù)處理(10mg/kg)對(duì)急性DU中毒(10mg/kg)具有明

12、顯的解毒作用,明顯提高了大鼠暴露于DU后30d的存活率,使暴露于DU4d后的尿鈾含量增加,肝、脾、腎鈾含量降低,血清BUN、Cr及尿液NAG顯著降低,并使血清IL-6和TNF-α、腎臟組織金屬硫蛋白MT-1、MT-2的基因表達(dá)水平明顯增高,CAT含量增高,丙二醛(MDA)含量降低,病理學(xué)損傷減輕。進(jìn)一步使用鋅預(yù)處理MT-/-小鼠和MT+/+小鼠,發(fā)現(xiàn)MT+/+小鼠的鈾含量明顯降低,且腎臟損傷明顯減輕,抗氧化能力增強(qiáng);但鋅預(yù)處理對(duì)MT-/

13、-小鼠卻沒(méi)有明顯的DU解毒效果。外源性MT的不同基因型(MT1和MT2)對(duì)DU解毒效果的研究發(fā)現(xiàn),MT1和MT2均可降低MT-/-小鼠腎臟的鈾含量,且MT-1可使腎臟的病理?yè)p傷明顯減輕,抗氧化能力增強(qiáng),而MT2的保護(hù)效果卻并不明顯。因此,鋅的解毒作用與誘導(dǎo)MT的合成有關(guān),一方面,MT可促進(jìn)DU的排出;另一方面,MT可增強(qiáng)體內(nèi)的抗氧化能力,拮抗DU對(duì)組織的損傷,并且MT1的作用更加明顯。
　　5.MT-/-小鼠和MT+/+小鼠暴露于

14、DU后,利用蛋白組學(xué)方法對(duì)小鼠腎臟組織蛋白的改變進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)有13個(gè)差異表達(dá)蛋白,它們的主要功能集中在糖和脂肪酸的代謝、電子傳遞呼吸鏈以及抗氧化防御系統(tǒng)等方面。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酰化酶-3(ACY-3)在暴露于DU后明顯降低,且MT-/-小鼠降低更為明顯,提示了這些蛋白可能參與了DU引起的腎臟中毒過(guò)程。采用免疫印跡技術(shù)對(duì)典型的差異蛋白SOD和ACY-3的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證,所得結(jié)果與蛋白組學(xué)研究結(jié)果相吻合,再次