T細(xì)胞疫苗對BXSB鼠免疫系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，SLE)是一種常見的自身免疫性疾病，累及全身多系統(tǒng)和器官，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床變化多端，繼發(fā)感染發(fā)生率高，診治困難，是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。其廣泛分布于世界各地，全世界的患病率大約是70/10萬-100/10萬[1]。如果以全國13億人口計算，我國的SLE患者已達(dá)112-160萬之多，且多見于年輕女性。 SLE的發(fā)病與多種因素有關(guān)，一般

2、認(rèn)為是遺傳素質(zhì)、性激素、感染、藥物和環(huán)境等相互間錯綜復(fù)雜的作用引起免疫調(diào)節(jié)功能紊亂，導(dǎo)致SLE的發(fā)生、持續(xù)和不易緩解。由于病因尚未明確，為其根治帶來困難。近20年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，早期診斷的手段增多和治療水平的提高，SLE的10年生存率已達(dá)92％[2]，預(yù)后明顯改善。然而糖皮質(zhì)激素結(jié)合免疫抑制劑藥物仍然是目前治療SLE的首選藥物。一般病例采用大劑量糖皮質(zhì)激素治療后小劑量維持，對急性暴發(fā)性危重SLE患者用激素沖擊療法，效果不理想

3、時聯(lián)合使用細(xì)胞毒藥物(主要是環(huán)磷酰胺和硫唑嘌呤)。采用這種常規(guī)治療方法可使大部分患者病情穩(wěn)定，但用藥量大、時間長，藥物的副作用不容忽視，如誘發(fā)或加重感染、糖尿病、消化道潰瘍、穿孔或消化道出血，長期應(yīng)用可引起高血壓和動脈粥樣硬化、骨折及骨缺血性壞死、精神異常、柯興綜合征、痤瘡、多毛等。60％以上患者最后死于激素的副作用和/或并發(fā)癥。嚴(yán)重影響患者的生存期和生活質(zhì)量[3]。 因此尋求SLE新的治療方法一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。大劑量免疫

4、球蛋白沖擊療法、血漿置換療法等，雖能使病情得到暫時緩解，同樣由于未能針對病因治療，且花費(fèi)高，不能廣泛應(yīng)用。新型免疫抑制劑包括B細(xì)胞治療、抗CD20抗單克隆抗體治療、T細(xì)胞治療、抗細(xì)胞因子治療、補(bǔ)體治療等大部分處于動物實(shí)驗(yàn)階段，其確切治療效果尚須大量臨床對照試驗(yàn)證實(shí)。近年來造血干細(xì)胞移植治療取得了令人鼓舞的療效，但存在高風(fēng)險和技術(shù)條件要求高，部分患者在動員階段不能耐受，價格昂貴，較難推廣[4]。 由于SLE是以T和B淋巴細(xì)胞功能異

5、常為主要特點(diǎn)的自身免疫性疾病，自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化及由此介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)是本病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)SLE發(fā)病過程中自身抗原應(yīng)答性輔助性T細(xì)胞(helpTcell，Th)增加。從狼瘡鼠克隆的T細(xì)胞系能向B細(xì)胞提供協(xié)助，使之產(chǎn)生IgG型抗DNA抗體。50％的這些T細(xì)胞克隆中能識別核小體中的T細(xì)胞抗原表位。在人及鼠SLE的Th細(xì)胞克隆中，識別核小體抗原表位的TCRa鏈能結(jié)合不同TCRβ鏈，形成TCRap二肽鏈，識別多種T細(xì)胞抗原表

6、位，協(xié)助多種B細(xì)胞克隆，產(chǎn)生多種自身抗體。在SLE遷延過程中，T細(xì)胞反復(fù)受自身抗原激活而增值，從而使突變率增加，其突變的T細(xì)胞能促使自身應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生抗DNA抗體。這些抗體與相應(yīng)自身抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球基底膜、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、小血管壁等多種器官及組織，活化補(bǔ)體、多型核白細(xì)胞及血小板，致局部炎癥及小血管炎，使血管阻塞，而顯示為多種臨床病癥[5]。如能通過T細(xì)胞免疫抑制自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的活化，控制SLE的發(fā)展，可能

7、是治療SLE的理想方法。 1981年Bennun等對Lewis大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimentalautoimmuneencephalomyelitis，EAE)的研究時，從發(fā)病鼠淋巴組織分離到一株髓鞘堿性蛋白(Myelinbasicprotein，MBP)特異性的自身反應(yīng)性T細(xì)胞。該細(xì)胞輸給正常大鼠可誘發(fā)EAE，但若在轉(zhuǎn)輸前用放射線照射或用絲裂霉素處理的方法滅火該細(xì)胞，則受鼠反而獲得對MBP免疫誘導(dǎo)的EAE的

8、抵抗力。此時第一次提出T細(xì)胞疫苗(Tcellvaccination)的概念，即用滅活或低于致病劑量的自身反應(yīng)性T細(xì)胞或其T細(xì)胞受體(Tcellreceptor，TCR)多肽作為疫苗接種，誘導(dǎo)或觸發(fā)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生特異性抑制作用，從而清除自身反應(yīng)性T細(xì)胞，達(dá)到防治自身免疫性疾病的作用[6]。近年來T細(xì)胞疫苗與自身免疫性疾病的關(guān)系得到廣泛研究，T細(xì)胞疫苗在自身免疫性疾病中的應(yīng)用也得到廣泛關(guān)注。在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、器官、組織移植術(shù)后，自

9、身免疫性甲狀腺炎，免疫性心肌炎等[7-9]疾病的臨床研究中均取得了令人滿意的結(jié)果，為治療難治性自身免疫性疾病的治療提供了新思路。本課題即運(yùn)用T細(xì)胞疫苗免疫的方法對SLE動物模型BXSB鼠進(jìn)行試驗(yàn)性治療，分析有關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)變化，旨在為T細(xì)胞疫苗臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 目的： 1、用BXSB鼠脾細(xì)胞制備T細(xì)胞疫苗。 2、觀察T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠24小時尿蛋白定量、血清ANA抗體、ds-DNA抗體

10、水平的動態(tài)變化，從而探討T細(xì)胞疫苗免疫在一定時間內(nèi)對BXSB鼠病情的影響。 3、觀察T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清IL-18水平動態(tài)變化，從而探討T細(xì)胞疫苗免疫在一定時間內(nèi)對BXSB鼠免疫狀態(tài)影響的有關(guān)機(jī)制。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)動物 雄性BXSB鼠12只。隨機(jī)分為2組。A組為2只，用來制備T細(xì)胞疫苗。B組10只，實(shí)驗(yàn)組，用來觀察T細(xì)胞疫苗對BXSB鼠的影響。 2、BXSB鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離：

11、 無菌條件下將BXSB鼠脾臟取下，制成脾細(xì)胞懸液，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，取淋巴細(xì)胞，用Hanks液清洗2次，最后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×108/ml。臺盼蘭染法鑒定活細(xì)胞數(shù)>95％。 3、T細(xì)胞疫苗的制備 用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至2×105/ml，加伴刀豆球蛋白A(ConA)混合后移置5％CO237℃孵箱中培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞，然后加入絲裂霉素C(mitomycinC)處理細(xì)胞，PBS洗滌后，用RP

12、MI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至1×108/ml備用。 4、T細(xì)胞疫苗皮下免疫： 取1×107細(xì)胞皮下免疫BXSB鼠，每周1次，連續(xù)3次，并于免疫前和首次免疫后第1w、2w、4w觀察有關(guān)指標(biāo)變化。 5、觀察指標(biāo)及檢測方法： 于免疫前和首次免疫后第1w、2w、4w將BXSB鼠斷尾取血，分離血清，ELISA法測血清ANA抗體、ds-DNA抗體和IL-18水平。用代謝籠收集BXSB鼠24小時尿量，考馬斯量藍(lán)染色法檢

13、測24小時尿蛋白定量。 結(jié)果： 1、T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠24小時尿蛋白定量差異有顯著意義(F=22.177，P=0.000)，呈遞減趨勢。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w與免疫前無顯著差異(P=0.519)，而免疫后2w和4w水平顯著低于免疫前和免疫后1w(P<0.05)，且免疫后4w水平低于免疫后2w(P=0.037)。 2、T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清ANA抗體水平差異有顯著意義(F

14、=15.757，P=0.000)，呈下降趨勢。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w與免疫前無顯著差異(P=0.317)，而免疫后2w和4w水平明顯低于免疫前和免疫后1w(P<0.05)，但兩者之間無顯著差異(P=0.072)。 3、T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清ds-DNA抗體水平有顯著差異(F=16.735，P=0.000)，呈下降趨勢。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w與免疫前無顯著差異(P=0.56

15、9)，而免疫后2w和4w水平顯著低于免疫前和免疫后1w(P<0.05)，但兩者之間無顯著差異(P=0.056)。 4、T細(xì)胞疫苗免疫前后BXSB鼠血清IL-18水平差異有顯著性意義(F=34.583，P=0.000)，呈遞減趨勢。免疫后1w、2w、4w均低于免疫前。免疫后1w與免疫前無顯著差異(P=0.130)，而免疫后2w和4w水平顯著低于免疫前和免疫后1w(P<0.05)，免疫后4w水平繼續(xù)降低，顯著低于免疫后2w(P=0.

16、006)。 5、首次免疫后4w，其中1只BXSB鼠死亡。 結(jié)論： 1、T細(xì)胞疫苗免疫BXSB鼠后2周其24小時尿蛋白定量、自身抗體水平即開始下降，免疫后4w仍維持較低水平。從而推測T細(xì)胞疫苗在一定時間內(nèi)可抑制BXSB鼠B細(xì)胞活化，減少自身抗體的產(chǎn)生，減輕腎臟損傷，延緩病情發(fā)展。 2、T細(xì)胞疫苗免疫BXSB鼠后2周其血清IL-18水平開始顯著降低，免疫后4w繼續(xù)降低。提示T細(xì)胞疫苗在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子的