醛固酮誘導(dǎo)管球反饋調(diào)節(jié)過程中一氧化氮和超氧化物在致密斑內(nèi)的相互作用.pdf

1、目的:
　　 高血壓病被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為導(dǎo)致心血管疾病患者死亡的主要因素，其多種機(jī)制都跟高血壓患者的外周血管阻力增高有關(guān)。大量證據(jù)顯示腎臟的水鹽代謝功能紊亂（尤其是腎臟內(nèi)的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)功能失調(diào)）和/或交感神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂是高血壓病發(fā)生發(fā)展的重要因素。
　　 管球反饋(Tubuloglomerularglomerularfeedback，TGF)是調(diào)節(jié)腎臟微循環(huán)和腎臟血流動(dòng)力學(xué)的重要機(jī)制，通過調(diào)節(jié)腎小球入

2、球小動(dòng)脈的收縮與舒張，改變腎小球的濾過率(Glomerularfiltrationrate，GFR)。而腎臟致密斑(Maculadensa，MD)細(xì)胞可以通過釋放一氧化氮(Nitricoxide，NO)而減弱TGF，使腎小球入球小動(dòng)脈舒張而增加GFR。而同樣來源于MD的超氧化物(Superoxide，O2-)，則可以使NO失活，TGF加深，最終減少GFR。但它們之間的相互作用以及它們跟TGF之間的具體作用還不明了。TGF受多種因素調(diào)節(jié)，

3、包括血管緊張素Ⅱ、腺苷、花生四烯酸代謝物、ATP、心房利鈉因子、NO和O2-等等。最近，我們發(fā)現(xiàn)由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的鹽皮質(zhì)激素——醛固酮在TGF反應(yīng)中也有重要的作用。
　　 蛋白激酶C(ProteinKinaseC，PKC)是一種調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)類固醇激素急性反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。PKC被證明在多種類型細(xì)胞上醛固酮誘導(dǎo)的信號(hào)通路中是一種重要的中介物。但是PKC信號(hào)通路在致密斑細(xì)胞上醛固酮的促氧化作用中是否有作用還不知道。
　　

4、 本論文的實(shí)驗(yàn)思路是:同時(shí)應(yīng)用體外培養(yǎng)細(xì)胞與應(yīng)用分離和微灌注球旁器(Juxtaglomerularapparatus，JGA)技術(shù)在活體組織中證明，在腎臟致密斑中醛固酮能夠刺激超氧化物產(chǎn)生，從而消除一氧化氮，進(jìn)而抵消一氧化氮對(duì)管球反饋的抑制作用。同時(shí)還研究PKC在醛固酮刺激超氧化物產(chǎn)生過程中的作用。
　　 第一部分:醛固酮刺激致密斑細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和超氧化物
　　 材料與方法
　　 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系
　　 本

5、實(shí)驗(yàn)中所使用的細(xì)胞為MMDDl(Maculadenselikecellline)細(xì)胞系，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院的DrJ.Schnermann提供，這種細(xì)胞系是由具有致密斑細(xì)胞特性的腎小管上皮細(xì)胞系培育而成。為確保細(xì)胞處于較好的活性狀態(tài)，只選用孵育至21-25代的MMDD1細(xì)胞。
　　 一氧化氮的檢測(cè)
　　 使用熒光檢測(cè)法檢測(cè)MMDD1細(xì)胞中生成NO的量。操作步驟主要為選用生長(zhǎng)面積達(dá)到70％-80％的細(xì)胞，加入能滲透細(xì)胞膜的一氧

6、化氮指示劑4，5-diaminofluoresceindiacetate(DAF-2DA)，作為熒光染料，將其溶于0.5％的dimethylsulfoxide(DMSO)溶液，濃度為10umol/L，作用細(xì)胞30min后，使用熒光顯微鏡檢測(cè)熒光，計(jì)算NO產(chǎn)量，然后加入或者不加入醛固酮作用15min然后再檢測(cè)NO產(chǎn)量。
　　 超氧化物的檢測(cè)
　　 使用Lucigenin增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)MMDD1細(xì)胞中生成O2-的量。操作

7、步驟主要為，選用生長(zhǎng)面積達(dá)到70％-80％的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffersolution，PBS)沖洗細(xì)胞兩次，加入1mL胰酶消化1-2min，5mlKrebs/Hepes緩沖液中和，離心，去上清后，加入12mLKrebs/Hepes緩沖液制備細(xì)胞懸濁液。通入氧氣，加入NAD(P)H，然后加入Lucigenin，加入或者不加入醛固酮后37C水浴30min，然后分別上機(jī)檢測(cè)。
　　 分離和微灌注球旁器

8、>　　 應(yīng)用跟以前報(bào)道的相似的分離和微灌注技術(shù)來處理入球小動(dòng)脈(Afferentglomerulararteriole，Af-Art)和附著的致密斑。取雄性新西蘭大白兔(1.5到2.0kg)用氯胺酮麻醉（45mg/kg，腹腔注射）。游離取下腎臟沿縱軸切片。通過立體顯微鏡顯微分離皮質(zhì)內(nèi)的腎小球及入球小動(dòng)脈、伴隨的髓袢升支粗段、致密斑還有遠(yuǎn)端小管起始端。分離完成后將其轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡中具備溫度調(diào)節(jié)功能的載物臺(tái)上。然后入球小動(dòng)脈和遠(yuǎn)端腎小管

9、起始端或者髓袢升支粗段插入玻璃毛細(xì)管裝置。顯微分離和微灌注要在8℃下60min以內(nèi)完成。然后標(biāo)本被轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡的載物臺(tái)上并浸入保持37℃的MEM溶液中完成剩余的實(shí)驗(yàn)。在檢測(cè)前可以等待30min的穩(wěn)定期。
　　 檢測(cè)被灌注的致密斑中超氧化物的產(chǎn)生
　　 選用對(duì)超氧化物敏感的熒光染料——dihydroethidium（二氫乙啶）來檢測(cè)超氧化物的含量水平。髓袢升支粗段持續(xù)灌注，致密斑細(xì)胞浸入含有二氫乙啶的MEM溶液中結(jié)合3

10、0min然后沖洗10min。致密斑細(xì)胞在380/490nm光線下照射來激活dihydroethidium和oxyethidium（氧乙啶）。收集并計(jì)算oxyethidium對(duì)dihydroethidium的比值變化作為超氧化物產(chǎn)量的指標(biāo)。先前發(fā)現(xiàn)增加灌注液中氯化鈉和醛固酮的濃度能促進(jìn)致密斑中一氧化氮的釋放，所以在MEM浸液跟致密斑灌注液中加入一氧化氮合酶(Nitricoxidesynthase，NOS)的拮抗劑N-nitro-L-arg

11、ininemethylester(L-NAME)來消除測(cè)量超氧化物的過程中一氧化氮對(duì)其影響。
　　 為了證明致密斑中醛固酮所誘導(dǎo)產(chǎn)生的超氧化物有時(shí)間依賴性，在含有L-NAME的灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮，然后每間隔15min檢測(cè)超氧化物的量，共檢測(cè)75min。
　　 統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用了t檢驗(yàn)，單因素方差分析(ANOVA)和post-hocFisherLSD檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用

12、均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮
　　 實(shí)驗(yàn)組基礎(chǔ)值是40.4±4.3U/min，加入醛固酮刺激15min后升為644.1±118.5U/min，而在對(duì)照組中，基礎(chǔ)值是45.9±5.2U/min，15min后為53.4±6.1U/min。
　　 醛固酮刺激MMDD1細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物
　　 沒有醛固酮處理的對(duì)照組基礎(chǔ)值是129

13、3±106RLU·s-1.105cells-1，有醛固酮處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組，升為2349±222RLU·s-1.105cells-1。
　　 醛固酮在分離灌注的致密斑中刺激超氧化物的產(chǎn)生
　　 將致密斑的灌注液中氯化鈉(NaCl)濃度從10mmol/L升至80mmol/L，然后用10-8或者10-7mol/L的醛固酮刺激15min，并沒有發(fā)現(xiàn)超氧化物的產(chǎn)生有明顯變化。推測(cè)是致密斑中由醛固酮誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮對(duì)超氧化物產(chǎn)生了

14、影響，為了消除一氧化氮的影響，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)超氧化物時(shí)向致密斑浸液和灌注液中加入10-4mol/LL-NAME。用NaCl（80mmol/L）灌注致密斑時(shí)，超氧化物量為9.4±1.5U/min。在灌注液中加入醛固酮（10-7mol/L）刺激15min，超氧化物產(chǎn)量增加到17.2±1.3U/min。加入醛固酮（10-8mol/L）對(duì)一氧化氮產(chǎn)生沒有明顯影響。
　　 在含有L-NAME的灌注液中加入醛固酮(10-7mol/L)，每

15、間隔15min檢測(cè)超氧化物，共檢測(cè)75min。結(jié)果顯示，致密斑中超氧化物的量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。
　　 結(jié)論
　　 醛固酮能刺激MMDD1細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和超氧化物，同時(shí)在分離并微灌注的活體組織致密斑上醛固酮能增加超氧化物的產(chǎn)生。
　　 第二部分醛固酮誘導(dǎo)產(chǎn)生的一氧化氮和超氧化物的相互作用以及對(duì)管球反饋的影響
　　 材料與方法
　　 分離和微灌注球旁器
　　 同第一部分。
　　

16、檢測(cè)一氧化氮和超氧化物的相互作用對(duì)管球反饋的影響
　　 將顯微分離的致密斑轉(zhuǎn)移到倒置顯微鏡中具備溫度調(diào)節(jié)功能的載物臺(tái)上并采用NaCl(10mmol/L)灌注等待30min穩(wěn)定期后，換用NaCl(80mmol/L)灌注液，檢測(cè)入球小動(dòng)脈管腔直徑5min。再換回NaCl(10mmol/L)的灌注溶液，藉由入球小動(dòng)脈前后直徑的變化反映管球反饋效應(yīng)的改變。
　　 將醛固酮加入腎小管的灌注液中灌注15min然后檢測(cè)管球反饋效應(yīng)的改

17、變，以此反映醛固酮在管球反饋調(diào)節(jié)過程中的作用。
　　 為了檢測(cè)超氧化物的清除劑哌啶(tempol)對(duì)管球反饋效應(yīng)的影響，向小管灌注液中加入超氧化物清除劑哌啶灌注15min然后檢測(cè)管球反饋效應(yīng)的改變。為了確定哌啶在管球反饋中的影響是否具有持續(xù)性，換回含有10mmol/LNaCl的灌注液并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。
　　 為了檢測(cè)致密斑中超氧化物的清除對(duì)醛固酮誘導(dǎo)的管球反饋的反應(yīng)性降低是否有作用，同時(shí)向小管灌注液中加入超氧化物清除劑哌啶

18、(tempol)和醛固酮灌注15min然后檢測(cè)管球反饋效應(yīng)的改變。
　　 檢測(cè)醛固酮誘導(dǎo)致密斑產(chǎn)生超氧化物的信號(hào)通路
　　 為了證明醛固酮誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生是否通過PKC調(diào)節(jié)，采用PKC的抑制劑并且重復(fù)上面分離微灌注致密斑的實(shí)驗(yàn)。將PKC的非特異性抑制劑Chelerythrinechloride(CC)加入含有80mmol/LNaCl的灌注液中灌注致密斑30min，檢測(cè)超氧化物的產(chǎn)量。然后在灌注液中加入10-7mol/L

19、的醛固酮刺激15min，并檢測(cè)超氧化物的產(chǎn)量。
　　 為了證明醛固酮誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生是否通過PKCα調(diào)節(jié)，采用PKCα抑制劑并且重復(fù)上面分離微灌注致密斑的實(shí)驗(yàn)。將PKCα特異性抑制劑Go10-7mol/L加入含有80mmol/LNaCl的灌注液灌注致密斑30min。檢測(cè)超氧化物的產(chǎn)量。然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min，并檢測(cè)超氧化物的產(chǎn)量。
　　 統(tǒng)計(jì)分析
　　 采用了t檢驗(yàn)，單因素方

20、差分析(ANOVA)和post-hocFisherLSD檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 致密斑中超氧化物的消除進(jìn)一步增強(qiáng)醛固酮在管球反饋中的作用
　　 首先測(cè)定了基礎(chǔ)值，當(dāng)灌注液中NaCl的含量從10mmol/L升到80mmol/L時(shí)，入球小動(dòng)脈管腔直徑從17.5±0.5um降到了15.1±0.5um，管球反饋為2.4±0.3um。<

21、br>　　 將10-7mol/L的醛固酮加入灌注液中灌注15min，當(dāng)灌注液中NaCl的含量從10mmol/L升到80mmol/L時(shí)，入球小動(dòng)脈的管腔直徑從17.6±0.5um降到了16.1±0.6um，管球反饋降為1.4±0.2um
　　 將10-4mol/L的哌啶加入灌注液中灌注15min，當(dāng)灌注液中NaCl的含量從10mmol/L升到80mmol/L時(shí)，入球小動(dòng)脈管腔直徑從17.2±0.5um降到了15.6±0.4um，

22、管球反饋為1.5±0.2um。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，將灌注液中NaCl的含量從10mmol/L再次升到80mmol/L，入球小動(dòng)脈管腔直徑顯示從17.3±0.6um降到了15.8±0.7um，管球反饋為1.4±0.2um。
　　 將10-4mol/L的哌啶和10-7mol/L的醛固酮同時(shí)加入灌注液中灌注15min，將灌注液中NaCl的含量從10mmol/L升到80mmol/L時(shí)，入球小動(dòng)脈管腔直徑從18.4±0.6um降到了18.1±0

23、.7um，管球反饋為0.4±0.2um。
　　 醛固酮刺激超氧化物產(chǎn)生過程是由PKCα信號(hào)通道介導(dǎo)
　　 將PKC的非特異性抑制劑CC10-7mol/L加入含有80mmol/LNaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的產(chǎn)量為7.3±1.1U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min，超氧化物的產(chǎn)量為5.9±1.7U/min。
　　 將PKCα的特異性抑制劑Go10-7mol/L加入

24、含有80mmol/LNaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的產(chǎn)量為7.9±1.2U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min，超氧化物的產(chǎn)量為6.3±1.5U/min。
　　 結(jié)論
　　 首次應(yīng)用分離和微灌注球旁器技術(shù)在活體組織中進(jìn)一步證明，醛固酮誘導(dǎo)超氧化物的產(chǎn)生增加能夠抵抗致密斑中一氧化氮對(duì)管球反饋的影響，從而調(diào)節(jié)管球反饋的反應(yīng)性;而且PKCα在調(diào)節(jié)致密斑中醛固酮誘導(dǎo)的超氧化物產(chǎn)生增