純鈦種植材料表面構(gòu)建生物活性過(guò)渡層的研究.pdf

1、鈦及鈦合金具有優(yōu)良的機(jī)械性能和生物相容性，在口腔及外科矯形種植領(lǐng)域中，是廣泛應(yīng)用的種植體材料。為了使鈦種植體具有明確的目標(biāo)性及特定分子間的可識(shí)別性，引導(dǎo)快速、特異的組織/界面反應(yīng)，促進(jìn)成骨細(xì)胞粘附、增殖和分化從而改善組織愈合，本課題首先對(duì)純鈦表面氧化膜進(jìn)行活化，再通過(guò)生物化學(xué)改性在表面構(gòu)建類細(xì)胞外基質(zhì)活性過(guò)渡層，并體外評(píng)價(jià)活性過(guò)渡層對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)的影響。 本課題包括四個(gè)部分： 1.純鈦表面氧化膜的化學(xué)活化及體外活性評(píng)價(jià)

2、 為了在鈦表面制備一層富含TiOH基團(tuán)的活性氧化膜，純鈦經(jīng)過(guò)堿或雙氧水處理后再進(jìn)行低溫?zé)崴惢?天。用XRD、XPS表征表面的化學(xué)成分及羥基含量，SEM觀察鈦表面氧化膜的微觀形貌，并考察改性后材料表面分別在細(xì)胞培養(yǎng)液和快速礦化液中誘導(dǎo)生成磷灰石的能力及對(duì)大鼠成骨細(xì)胞的增殖的影響。結(jié)果顯示，化學(xué)處理后鈦表面為微孔結(jié)構(gòu)，低溫?zé)崴惢静桓淖兾⒖捉Y(jié)構(gòu)且使表面非晶態(tài)層轉(zhuǎn)化為富含羥基的二氧化鈦層。浸泡于細(xì)胞培養(yǎng)液10天后表面有顆粒型物質(zhì)

3、沉積，雖然XRD難以檢測(cè)出，但能譜分析表明表面沉積有鈣、磷元素等。浸泡在快速礦化液中，改性表面有磷灰石的形成。細(xì)胞學(xué)評(píng)價(jià)顯示化學(xué)處理再進(jìn)行熱水陳化的氧化膜表面能無(wú)細(xì)胞毒性，后期還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。表明化學(xué)處理(尤其是NaOH處理)后再熱水陳化的鈦表面有良好的生物相容性，表面氧化膜富含的羥基不僅增加了材料的活性，而且還可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中固定生物大分子的功能基團(tuán)，為金屬材料的生物化、智能化奠定基礎(chǔ)。 2.膠原在鈦表面活性氧化膜上

4、的吸附和化學(xué)接枝 利用原子力顯微鏡(AFM)、分光光度法觀察和分析了3種不同濃度的膠原溶液在改性鈦氧化膜和純鈦表面的自組裝吸附情況。通過(guò)3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)活化鈦表面羥基后，以碳二亞胺(EDC)為偶聯(lián)劑，將膠原接枝在鈦氧化膜表面，XPS、AFM、SEM表征其表面膠原。結(jié)果顯示，低濃度時(shí)膠原在兩種鈦表面只是簡(jiǎn)單的吸附，隨著濃度的增加，膠原吸附量增多，在改性鈦表面組裝形成網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)，而在純鈦表面組裝成纖維結(jié)構(gòu)。這表明膠原

5、蛋白有在鈦表面進(jìn)行自組裝的特性，自組裝的結(jié)果與膠原濃度、鈦表面性質(zhì)很大的關(guān)系。硅烷反應(yīng)及EDC偶聯(lián)后，XPS譜及原子力顯微鏡證實(shí)了接枝反應(yīng)的發(fā)生，但接枝量較低，如同時(shí)保留鈦表面物理吸附的膠原層，則使表面膠原量提高明顯。共價(jià)接枝/物理吸附膠原的鈦試樣經(jīng)磷酸鹽緩沖液浸洗7天后，表面的膠原含量改變較小，表明共價(jià)接枝使涂層更加穩(wěn)定，表面接枝/吸附膠原后的鈦有望成為新的分子生物型材料。 3.純鈦表面類細(xì)胞外基質(zhì)活性過(guò)渡層的構(gòu)建 將

6、膠原與殼聚糖復(fù)合后化學(xué)接枝/物理吸附至鈦表面，再通過(guò)偶聯(lián)劑EDC偶聯(lián)rhBMP-2，在鈦表面構(gòu)建了類細(xì)胞外基質(zhì)活性層。采用高效色譜分析法，測(cè)定表面復(fù)合層rhBMP-2釋放性能。結(jié)果顯示鈦表面的膠原-殼聚糖復(fù)合層為纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在體外PBS中，復(fù)合層具有早期快速少量釋放rhBMP-2并能持續(xù)一定時(shí)間的特點(diǎn)。在膠原/殼聚糖層采用EDC偶聯(lián)的rhBMP-2比物理吸附的釋放更為平緩，且釋放也更持久。表明在鈦表面由膠原、多糖和骨形成蛋白構(gòu)建的類細(xì)

7、胞外基質(zhì)層是與機(jī)體相適應(yīng)的過(guò)渡層，將能充當(dāng)鄰近細(xì)胞、組織的配基或受體，膠原與殼聚糖涂層在發(fā)揮支架作用的同時(shí)，還可作為rhBMP-2的載體。 4.純鈦表面活性過(guò)渡層對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)的影響 原代組織塊法培養(yǎng)大鼠顱項(xiàng)骨成骨細(xì)胞，通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的3-6代成骨細(xì)胞在各改性表面黏附、增殖及分化的檢測(cè)，評(píng)價(jià)純鈦表面活性類細(xì)胞外基質(zhì)層對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示Ti/col和Ti/ECM-like兩組可促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期黏附，用免疫熒

8、光的方法對(duì)細(xì)胞骨架蛋白觀察發(fā)現(xiàn)以上兩組在短時(shí)間內(nèi)可使形成良好的鋪展形態(tài)；倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察及MTT結(jié)果表明膠原層和類細(xì)胞外基質(zhì)層雖然早期不能增加成骨細(xì)胞增殖活性，但有機(jī)層為細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)提供了機(jī)會(huì)，培養(yǎng)后期促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)；改性三組的材料表面都增加了成骨細(xì)胞的ALP活性和細(xì)胞基質(zhì)層的鈣含量，但Ti/ECM-like組促進(jìn)效果最明顯，改善了鈦表面的生物功能性。表明，鈦活性過(guò)渡層具有良好的生物相容性，可促進(jìn)成骨細(xì)胞在活性層表面