炎癥微環(huán)境下人牙齦固有層間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、牙齦是附著在牙頸和牙槽突部分的粘膜組織，呈現(xiàn)粉紅色，有光澤，質(zhì)堅(jiān)韌，是口腔粘膜的一部分。它擔(dān)負(fù)著牙周組織與口腔環(huán)境的粘膜屏障，維持口腔健康。從組織學(xué)和功能學(xué)上看，由于牙齦具有耐受咀嚼食物所產(chǎn)生的摩擦力的特性，因此它屬于咀嚼粘膜，以此和頰側(cè)的被覆粘膜和唇側(cè)粘膜得以區(qū)分。牙齦組織由上皮和固有層兩部分組成，固有層由顱神經(jīng)嵴發(fā)育而成，與之同源還有顱面其它間充質(zhì)來源的組織，包括牙乳頭和牙周組織。一些文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)，大量的顱神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)

2、得到證實(shí)，它們無論在維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上還是在再生治療中都可以發(fā)揮重要的作用。然而，盡管已經(jīng)確認(rèn)牙齦來源的細(xì)胞是上皮/原始干細(xì)胞，但是幾乎還沒有研究對牙齦來源的細(xì)胞鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　目前一些對牙齦成纖維細(xì)胞的研究，認(rèn)為還不能從其中區(qū)分出已經(jīng)有證據(jù)存在的牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。但是近期有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，已經(jīng)可以成功從人牙齦組織中分離培養(yǎng)出牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(gingivalmesenchymalstemcell，GMSC)。這些GMSC無

3、論是在體內(nèi)環(huán)境還是在體外環(huán)境都顯示出自我更新，多向分化和免疫調(diào)節(jié)的能力。而這些特征正好與Fournier等人發(fā)表的文章中所闡述的牙齦成纖維細(xì)胞顯示出原始細(xì)胞的特性相似，包括體外低密度細(xì)胞形成克隆形成率（colonyformingunit-fibroblastic，CFU-F）和體內(nèi)多向分化。當(dāng)前，各種人的間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)獲得認(rèn)可，并且應(yīng)用于臨床治療中。早先的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為運(yùn)用分離和培養(yǎng)技術(shù)，間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎可以從人的器官和組織甚至從它們的胚胎

4、中獲得。
　　我們知道臨床上慢性牙齦炎導(dǎo)致的牙齦增生原因復(fù)雜，表現(xiàn)也較不均一，而正畸治療中出現(xiàn)的牙齦炎性增生屬于僅與牙菌斑有關(guān)的牙齦病，表型穩(wěn)定，炎癥是其發(fā)生發(fā)展的最主要原因。并且有研究表明，正畸治療和未經(jīng)正畸治療牙齦炎性增生的發(fā)生率是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，和矯治力無關(guān)，而與口腔衛(wèi)生相關(guān)，。
　　本課題旨在通過對人正常和牙菌斑導(dǎo)致的炎性增生牙齦的組織學(xué)，細(xì)胞學(xué)觀察，探討它們在原位的組織學(xué)特征和存在GMSC干細(xì)胞的標(biāo)記物。然后從這兩

5、種牙齦組織中分離培養(yǎng)GMSC：正常牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（gingivalmesenchymalstemcellfromnormalgingivaltissue，N-GMSC）、炎性增生牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞（gingivalmesenchymalstemcellfrominflammationofgingivalhyperplasiatissue，I-GMSC）應(yīng)用單克隆分離和擴(kuò)增方法，證明它們都具有克隆形成能力和高度增殖能力，比較N-GMSC和

6、I-GMSC成骨和成脂特性的差異，及其細(xì)胞外基質(zhì)、相關(guān)蛋白酶、炎性因子的變化特點(diǎn)。建立炎癥微環(huán)境這一穩(wěn)定的系統(tǒng)，研究炎癥微環(huán)境對牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的影響。初步探討正畸治療中牙齦炎性增生的發(fā)病機(jī)制，為探索新的預(yù)防和治療策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分人正常牙齦和炎性增生牙齦組織學(xué)觀察
　　實(shí)驗(yàn)一、人正常牙齦和炎性增生牙齦組織學(xué)觀察采用組織學(xué)方法觀察正常牙齦和炎性增生牙齦組織學(xué)特征。結(jié)果表明：正常牙齦組織，呈現(xiàn)粉紅色，有光澤

7、，質(zhì)堅(jiān)韌。炎性增生牙齦組織，牙齦充血，失去正常的解剖外形，并且紅腫增生。炎性增生牙齦HE組織切片顯示，其上皮釘突明顯，固有層大量淋巴細(xì)胞浸潤。
　　實(shí)驗(yàn)二、人正常牙齦和炎性增生牙齦干細(xì)胞特異性標(biāo)志物的比較采用免疫熒光組織化學(xué)方法原位觀察兩種牙齦組織和細(xì)胞爬片。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常牙齦組織呈現(xiàn)出的干細(xì)胞的篩選標(biāo)志-1（STROL-1）和早期胚胎糖脂抗-4（stage-specificembryonicantigen4，SSEA-4）含量大

8、于炎性增生牙齦組織，提示N-GMSC和I-GMSC存在各自組織中含量的差異，可能同時(shí)也具有骨/脂向分化潛力的差異；炎性增生牙齦組織細(xì)胞外基質(zhì)Ⅰ型膠原（collagen-1，COL-1）含量大于正常牙齦組織，N-GMSC和I-GMSC細(xì)胞爬片的結(jié)果符合它們所來源的組織免疫熒光組織化學(xué)COL-1的染色結(jié)果，提示兩種組織的細(xì)胞外基質(zhì)含量的差異，可能是造成它們的臨床出現(xiàn)的不同表型的原因。
　　第二部分人正常牙齦和炎性增生牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞分

9、離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性的初步研究
　　實(shí)驗(yàn)一、N-GMSC和I-GMSC的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定兩種來源牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定。采用酶消化法分離培養(yǎng)原代牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞。結(jié)果表明：離體的牙齦組織包含結(jié)構(gòu)完整的間充質(zhì)組織，表明本實(shí)驗(yàn)使用的方法能夠分離出GMSC，它可以迅速貼壁，伸展后細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或三角形。
　　實(shí)驗(yàn)二、N-GMSC和I-GMSC體外培養(yǎng)生物學(xué)特性檢測采用有限稀釋法細(xì)胞接種于大培養(yǎng)皿中，通過克

10、隆形成率檢測，從而明確兩種狀態(tài)來源的牙齦組織中GMSC干細(xì)胞克隆形成的差異。流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometric，F(xiàn)CM）分別檢測來源于間充質(zhì)的N-GMSC和I-GMSC表面標(biāo)志：陽性表達(dá)-STRO-1、CD29、CD44、CD90、CD105、CD146；陰性表達(dá)-CD34、CD45。檢測結(jié)果表明：N-GMSC和I-GMSC形成克隆的能力無明顯差異，但是在相同時(shí)間中N-GMSC克隆個(gè)體大于I-GMSC。提示炎癥導(dǎo)致的牙齦增生組織中

11、仍然存在間充質(zhì)干細(xì)胞。N-GMSC表達(dá)的STRO-1、CD146高于I-GMSC，標(biāo)志物的表達(dá)提示GMSC與來源于其他間充質(zhì)組織（牙髓）的干細(xì)胞具有同源性，并且N-GMSC干細(xì)胞表達(dá)大于I-GMSC。
　　實(shí)驗(yàn)三、N-GMSC和I-GMSC多向分化能力檢測采用堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性檢測、礦化結(jié)節(jié)染色、脂滴染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptionpolymeras

12、echainreaction，RT-PCR）檢測成骨/成脂相關(guān)基因表達(dá)的方法，檢測了N-GMSC和I-GMSC在體外的分化能力。結(jié)果表明：N-GMSC在體外顯示了較I-GMSC更高的礦化和成脂能力。提示N-GMSC干細(xì)胞能力強(qiáng)于I-GMSC，I-GMSC干細(xì)胞能力降低，是因?yàn)樵谘装Y微環(huán)境中會促使GMSC提前進(jìn)入瞬時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞（transit-amplyfingcells，TA）的狀態(tài)。
　　第三部分炎癥微環(huán)境對人正常牙齦組織來源的間

13、充質(zhì)干細(xì)胞影響
　　實(shí)驗(yàn)一、N-GMSC和I-GMSC增殖差異和以此特性建立體外穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境。甲基噻唑基四唑檢測(methylthiazolyltetrazolium，MTT)以及細(xì)胞周期(cellcycle，CC)檢測明確N-GMSC和I-GMSC增殖能力差異，根據(jù)它們的增殖特點(diǎn)，確定用外源性炎性因子：白介素-1（nterleukin-1beta，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-alp

14、ha，TNF-α）建立體外穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境的濃度，觀察N-GMSC在炎癥微環(huán)境中凋亡能力的變化。結(jié)果表明：I-GMSC增殖能力強(qiáng)于N-GMSC，符合炎性增生牙齦的組織學(xué)特點(diǎn)。炎癥環(huán)境對干細(xì)胞的影響是其中的炎性因子對它的影響，外源性炎性因子IL-1β(5ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)建立穩(wěn)定的炎癥微環(huán)境：MTT檢測N-GMSC在IL-1β(5ng/ml)和TNF-α(10ng/ml)炎性因子作用下增殖最高，符合MTT和細(xì)胞周期

15、檢測結(jié)果顯示I-GMSC具有強(qiáng)增殖能力。我們還發(fā)現(xiàn)N-GMSC在炎性因子作用下凋亡增加，在成骨誘導(dǎo)分化階段，凋亡數(shù)量都會隨著作用時(shí)間的延長呈現(xiàn)增多的趨勢。
　　實(shí)驗(yàn)二、N-GMSC和I-GMSC細(xì)胞因子基因表達(dá)差異的比較RT-PCR檢測N-GMSC和I-GMSC基因表達(dá)的差異。結(jié)果顯示：I-GMSC的基質(zhì)金屬蛋白酶1/2（matrixmetalloproteinase1/2，MMP1/2）表達(dá)量減少；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1/2（m

16、etallopeptidaseinhibitor1/2，TIMP1/2）、IL-1α/6、COL-1、TNF-α表達(dá)量增多。提示是否這些表達(dá)變化是GMSC在炎癥狀態(tài)中特有的變化趨勢？
　　實(shí)驗(yàn)三、N-GMSC和對照組正常牙髓干細(xì)胞（normaldentalpulpstemcell，N-DPSC）在炎癥微環(huán)境中細(xì)胞因子基因表達(dá)的比較RT-PCR檢測N-GMSC和對照組N-DPSC在炎性微環(huán)境中基因表達(dá)。結(jié)果顯示：N-GMSC在體外炎

17、癥微環(huán)境中，MMP1/2的表達(dá)量變化與TIMP1/2的表達(dá)量變化成負(fù)相關(guān)，即炎性因子作用8h時(shí)TIMP1/2表達(dá)量最高，而同一時(shí)間測定的MMP1/2表達(dá)量最低。對照組的N-DPSC：MMP1/2隨著炎性因子作用時(shí)間，基因表達(dá)量逐漸增加，而TIMP1/2基因表達(dá)量逐漸減少。提示為GMSC在炎癥微環(huán)境中MMPs與TIMPs表達(dá)變化規(guī)律具有其特異性。隨著炎性因子的作用時(shí)間IL-1α/6、COL-1、TNF-α表達(dá)量增加。GMSC表達(dá)的IL-1

18、α相對DPSC的要強(qiáng)，而DPSC表達(dá)的IL-6相對GMSC的強(qiáng)。提示兩種組織來源的干細(xì)胞（GMSC、DPSC）在炎癥微環(huán)境中的表達(dá)IL-1α，IL-6表達(dá)量的差異，是不是因此造成它們所表達(dá)MMPs、TIMPs變化趨勢不同的原因呢?所以最終導(dǎo)致牙齦和牙髓在炎癥中表現(xiàn)出的不同表型，一個(gè)為組織的增生，一個(gè)為組織的液化。
　　實(shí)驗(yàn)四、N-GMSC、N-GMSC(外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)細(xì)胞膜片裸鼠皮下

19、移植的實(shí)驗(yàn)研究將N-GMSC、N-GMSC(外源性炎性因子)、N-DPSC、N-DPSC(外源性炎性因子)制成細(xì)胞膜片移植入裸鼠皮下，2周后取材。對其進(jìn)行組織免疫熒光組織化學(xué)染色，以探討組織細(xì)胞膜片在體內(nèi)MMP1、TIMP1表達(dá)含量符合體外基因表達(dá)的特點(diǎn)。牙齦與牙髓組織在炎癥中的表型不相同，它們的干細(xì)胞屬于組織特異的干細(xì)胞，在炎性微環(huán)境中它們的MMPs與TIMPs表達(dá)量的變化趨勢也是不同的。可以認(rèn)為GMSC在炎癥微環(huán)境中MMPs與TIM