代謝活化系統(tǒng)在人細胞轉化模型中的應用.pdf

1、隨著人類社會的發(fā)展，越來越多的化學致癌物進入人們的生活，目前致癌物的檢測方法存在很多不足，促使人們尋找更加敏感、特異、快速的檢測方法。細胞轉化試驗作為一種化學致癌物檢測模型越來越受到人們的重視。 通過人為改變?nèi)嗽毎幸恍┌┗蚧蛞职┗虻谋磉_，能使其逃脫老化而獲得永生化。盡管這些永生化細胞獲得了無限增殖的能力，但沒有獲得惡性細胞的表型，在永生化的細胞中繼續(xù)導入其他的癌基因，最終使細胞發(fā)生惡性轉化。在轉化前的階段，細胞并沒有惡

2、性表型，而是處于逐漸發(fā)牛轉化的易感狀態(tài)，處于此階段的細胞在致癌因素作用下比正常的永生化細胞更容易發(fā)生轉化。因此，我們選取處于轉化前期易感階段的細胞作為模型，來檢測致癌物的致癌活性。 本課題組已經(jīng)證實，處于易感狀態(tài)的細胞(高表達H-RasV12和c-Myc的永生化呼吸道上皮細胞)對直接致癌物的敏感性比正常細胞高。說明此細胞轉化模型對于直接致癌物的檢測有很高的靈敏度。而環(huán)境中除了直接致癌物外，絕大部分是間接致癌物，必須經(jīng)過代謝活化才

3、具有致癌活性。所以細胞轉化模型中必須包括一個代謝系統(tǒng)來活化間接致癌物。目前，在致癌活性檢測中，S9雖然是經(jīng)典的代謝系統(tǒng)，但存在很多不足。與S9相比，細胞內(nèi)的活化系統(tǒng)代謝能力更強，彌補了S9的很多不足。細胞內(nèi)代謝包括在細胞中高表達特異性代謝酶和誘導特異性代謝酶的表達。 我們選擇永生化人肝細胞，導入第12密碼子突變的H-Ras癌基因，使其處于惡性轉化前的易感狀態(tài)。采用三種代謝系統(tǒng)：高表達CYP1A2，底物誘導CYP1A2的高表達和S

4、9，選擇具有代表性的間接致癌物黃曲霉毒素B1(Aflotoxin B1，AFB1)作用于永生化和轉化前期細胞株，通過軟瓊脂克隆形成試驗和裸鼠皮下成瘤試驗驗證在代謝系統(tǒng)的活化下，間接致癌物誘導細胞轉化的作用，探討活化系統(tǒng)在人細胞轉化模型中應用的可行性，為間接化學誘變物和致癌物的檢測提供穩(wěn)定、操作簡便、靈敏度高、特異度好和更接近人體的活化系統(tǒng)。 研究方法： 1.1 RAS高表達細胞株L02-R和ST高表達細胞株L02-RST

5、的建立利用逆轉錄病毒載體介導的方法在人永生化肝細胞L02的基礎上構建癌基因H-RasV12(V12，第12密碼子突變)高表達的細胞株L02-R，免疫印跡檢測RAS蛋白的表達。為了提供與L02-R基因背景接近的陽性對照細胞，L02-R中導入SV-40的小T抗原(SV 40 small antigen，ST)。通過綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達檢測ST的蛋白表達。通過形態(tài)學觀察、繪制生長曲線

6、以及惡性轉化試驗觀察所構建細胞株的生物學特性。 1.2.三種代謝系統(tǒng)的建立和評價 1.2.1 S9代謝活化系統(tǒng)的制備和檢測多氯聯(lián)苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)誘導大鼠，常規(guī)方法制備S9，BCA法測定S9的蛋白含量，Ames試驗測定S9的代謝活性。 1.2.2高表達CYP1A2細胞株的建立用BamHI和XhoI酶切pCR2.1-ToPo-CYP1A2，得到CYP1A2，連接到逆轉

7、錄病毒載體pMIG上，獲得pMIG-CYP1A2質(zhì)粒。用逆轉錄病毒pMIG-CYP1A2表達載體在L02-R的基礎上建立高表達CYP1A2的細胞株L02-RA。免疫印跡測定CYP1A2蛋白的表達，P450-GLOTM試劑盒測定CYP1A2的酶活性。 1.2.3 AFB1對L02細胞中CYP1A2的誘導效應用0.1μM AFB1誘導48小時后換成新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)維持培養(yǎng)到96小時，分別在誘導的24、48、72和96小時測定CYP1A

8、2的表達，來確定誘導效應最強的時間點。用免疫印跡測定CYP1A2的表達，P450-GLOTM試劑盒測定CYP1A2的酶活性。 1.3AFB1誘導細胞轉化實驗 1.3.1 AFB1染毒濃度的確定： 在相同的染毒濃度下，測定三種代謝系統(tǒng)活化AFB1所引起的細胞毒性。選擇其中毒性最大的IC50的50％、20％和5％作為染毒劑量。 1.3.2細胞轉化試驗每周染毒一次，連續(xù)染毒四次。染毒后第5周開始每隔兩周做一次軟

9、瓊脂試驗，直至陽性結果出現(xiàn)；連續(xù)兩次軟瓊脂試驗出現(xiàn)陽性結果后進行裸鼠皮下成瘤試驗。 結果： 2.1 RAS和ST高表達細胞株的建立免疫印跡檢測RAS蛋白表達的結果顯示L02-R的RAS表達比對照細胞升高約5倍。L02-RST熒光蛋白的表達效率較高，達到80％。與L02相比，L02-R和L02-V在形態(tài)上沒有明顯改變。L02-RST細胞體積變大，失去了原來的多角形形態(tài)，出現(xiàn)局部重疊生長的現(xiàn)象，提示細胞已經(jīng)失去正常的接觸抑制

10、，出現(xiàn)惡性表型。L02-V和L02-R的生長速度比較接近，L02-RST的生長速度最快。軟瓊脂試驗結果顯示，L02-V、L02-R偶見克隆形成；而L02-RST形成較多克隆。裸鼠試驗結果顯示L02、L02-V和L02-R在接種后3個月內(nèi)均未能在裸鼠皮下形成腫瘤；而L02-RST則在接種后第10天長出肉眼可見的腫瘤。 2.2三種代謝系統(tǒng)的建立和評價 2.2.1 S9代謝系統(tǒng)的建立Ames試驗檢測S9的活性的結果說明S9能夠

11、代謝間接致癌物。 2.2.2高表達CYP1A2細胞株的建立免疫印跡測定結果顯示L02-RA中CYP1A2的表達結果比對照升高約5倍。酶活性的測定結果與免疫印跡的結果一致。與對照細胞相比，L02-RA和L02-VA在形態(tài)學上未見明顯改變，CYP1A2的導入并未影響細胞的生長形態(tài)。L02-RA和L02-R細胞的倍增時間分別是33.53小時和34.85小時，提示CYP1A2導入對L02R細胞的生長速度影響不大。L02-VA、L02-R

12、A的軟瓊脂實驗和裸鼠實驗的結果均為陰性。 2.2.3 AFB1誘導L02細胞CYPIA2的高表達免疫印跡測定AFB1誘導L02細胞CYP1A2的高表達，結果顯示CYP1A2蛋白的表達于誘導48小時達到高峰，當撤掉AFB1后，CYP1A2蛋白的表達開始下降，但于72和96小時仍可觀察到明顯的CYPlA2表達。酶活性測定的結果顯示，AFB1能夠誘導CYP1A2的表達，并且有劑量反應關系。 2.3.AFB1誘導細胞轉化實驗

13、 2.3.1染毒濃度的確定S9活化AFB1后，引起的細胞毒性最強。根據(jù)抑制率和濃度的回歸方程計算S9活化AFB1的IC50是0.64μM，不加活化系統(tǒng)時，AFB1的IC50是5.24μM。根據(jù)有S9活化時AFB1的半數(shù)抑制濃度IC50確定三種活化系統(tǒng)的染毒濃度為0.3μM、0.1μM和0.03μM。 2.3.2細胞轉化試驗： (1)AFB1經(jīng)三種代謝系統(tǒng)活化后均可誘導高表達RasV12的細胞株在不同的時間發(fā)生轉化，在

14、染毒20周內(nèi)均未能誘導對照細胞L02-V發(fā)生轉化。 (2)未加代謝系統(tǒng)的條件下，經(jīng)AFB1染毒的L02-R在第17周發(fā)生轉化：而加入S9時，在第8周發(fā)生轉化，比L02-R縮短了9周；經(jīng)0.1μMAFB1誘導和高表達CYP1A2均使轉化問期縮短6周，于第11周發(fā)生轉化。 (3)細胞轉化的效應與AFB1有劑量和時間效應關系。 結論： 1.成功構建了癌基因H-RasV12和P450 CYP1A2穩(wěn)定高表達的轉基

15、因細胞株。所構建的細胞株在生長形態(tài)、生長速度、錨著獨立性生長等生物學特性未發(fā)生明顯改變，沒有獲得惡性轉化的表型。在高表達H-Ras的基礎上繼續(xù)導入SV40 ST能誘導細胞發(fā)生惡性轉化。 2.三種代謝系統(tǒng)：大鼠肝微粒體組份S9、AFB1低劑量誘導和細胞高表達CYP1A2都能夠促進間接致癌物AFB1的代謝活化，縮短細胞轉化的時間，提高細胞轉化效率。 3.從試驗操作難度、試驗的重復性、試驗結果的可靠性等幾個方面比較三種代謝系統(tǒng)