細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型在化學(xué)致癌物篩查中的應(yīng)用研究.pdf

1、隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的化學(xué)致癌物進(jìn)入人類的生活和生產(chǎn)領(lǐng)域，其中很多具有潛在致癌性。目前的人類化學(xué)致癌物檢測手段由于自身局限性，遠(yuǎn)不能滿足人類可疑化學(xué)致癌物檢測日益增長的需要，這促使人們尋找快速有效的檢測方法。
　　 細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗是一種化學(xué)致癌活性的短期檢測模型，能檢測遺傳毒性和非遺傳毒性化學(xué)致癌物，日益受到人們的關(guān)注。本課題組已證實，癌基因高表達(dá)人永生化細(xì)胞模型如高表達(dá)H-RasV12和c-Myc的永生化人支氣管上皮細(xì)胞

2、(human bronchial epithelialcell，HBE)具有靈敏度好、能縮短細(xì)胞轉(zhuǎn)化間期和檢測各種類型的化學(xué)致癌物等優(yōu)點，是一種具有應(yīng)用前景的化學(xué)致癌物檢測手段。
　　 體內(nèi)外研究表明，細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化是一個多階段、涉及多基因突變的過程。癌基因高表達(dá)通過加速基因突變頻率促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。DNA修復(fù)缺陷能加快細(xì)胞基因突變，理論上也能象癌基因高表達(dá)一樣促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。許多臨床資料表明DNA修復(fù)缺陷是腫瘤的重要易感因素之

3、一。核酸切除修復(fù)機(jī)制中關(guān)鍵基因如ERCC1(excision repaircross-completion gene1)和ERCC2(excision repair cross-completion gene2)、DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制中關(guān)鍵基因如ATM(ataxia-telangiectasia mutated gene)和錯配修復(fù)機(jī)制中關(guān)鍵基因如MSH2(mutS homolog2)的功能缺失均能引起人類腫瘤早發(fā)、多發(fā)。動物研究也表

4、明一些DNA修復(fù)基因敲除小鼠是良好的化學(xué)致癌活性檢測模型[1-4]。除此之外，DNA修復(fù)缺陷使人上皮細(xì)胞對病毒癌基因誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化更加敏感[5，6]。因此，我們推測，人DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞模型有可能運用于化學(xué)致癌活性短期檢測系統(tǒng)。
　　 本課題選擇H-RasV12和c-Myc高表達(dá)的人支氣管上皮細(xì)胞和DNA損傷修復(fù)基因缺陷的人支氣管上皮細(xì)胞，選擇人類確證化學(xué)致癌物苯并芘[benzopyrene，B(a)P]作用于上述兩種類型的細(xì)胞

5、株，通過軟瓊脂克隆形成試驗和裸鼠皮下成瘤試驗驗證不同通路的DNA損傷修復(fù)基因缺陷能否促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，比較癌基因高表達(dá)和DNA損傷修復(fù)基因缺陷細(xì)胞模型在化學(xué)致癌活性檢測中的效能，進(jìn)一步完善人細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型，為人細(xì)胞轉(zhuǎn)化模型的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 1.研究方法
　　 1.1 DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞株的建立
　　 采用慢病毒載體介導(dǎo)的siRNA技術(shù)在人支氣管上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上構(gòu)建DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE

6、細(xì)胞株HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2，RT-PCR方法檢測各DNA損傷修復(fù)基因mRNA的表達(dá)。通過形態(tài)學(xué)觀察、生長增殖以及惡性轉(zhuǎn)化試驗觀察所構(gòu)建細(xì)胞株的生物學(xué)特性
　　 1.2.DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞株DNA損傷修復(fù)能力的檢測
　　 通過雙核微核實驗和彗星實驗檢測所構(gòu)建DNA損傷修復(fù)缺陷細(xì)胞株的DNA損傷修復(fù)能力。
　　 1.3 B(a)P誘導(dǎo)細(xì)

7、胞轉(zhuǎn)化實驗
　　 1.3.1 B(a)P染毒濃度的確定：
　　 采用臺盼蘭染色法，檢測B(a)P對HBE細(xì)胞的IC50。選擇6.25％IC50、12.5％IC50和25％ICs0作為HBE細(xì)胞苯并芘染毒劑量。
　　 1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗
　　 每周染毒一次，連續(xù)染毒。染毒后第4周開始每隔兩周做一次軟瓊脂試驗；連續(xù)兩次軟瓊脂試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果后進(jìn)行裸鼠皮下成瘤試驗。
　　 2.結(jié)果
　　 2

8、.1 DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞株的建立
　　 RT-PCR法檢測結(jié)果表明，各DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞均構(gòu)建成功。與HBE-shGFP相比，各DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞在形態(tài)上沒有明顯改變，沒有惡性轉(zhuǎn)化表型，但HBE-shATM和HBE-shMSH2細(xì)胞株的生長速度減慢。
　　 2.2 DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞株DNA損傷修復(fù)能力檢測
　　 2.2.1雙核微核實驗結(jié)果
　　 雙核微核實驗結(jié)果

9、表明：1.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2細(xì)胞的NDI值與B(a)P濃度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，5μMB(a)P作用24小時，與對照細(xì)胞相比，各DNA修復(fù)缺陷HBE細(xì)胞株NDI值分別降低了16.77％、13.30％、29.26％和16.49％；2.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH

10、2細(xì)胞的雙核細(xì)胞微核率與B(a)P濃度呈正相關(guān)關(guān)系，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，5μMB(a)P作用24小時，分別為對照細(xì)胞的1.95倍、1.88倍、2.53倍和2.64倍；3.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2細(xì)胞的核橋雙核細(xì)胞率與B(a)P濃度呈正相關(guān)關(guān)系，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中只有HBE-shATM和HBE-shMSH2的核橋雙核細(xì)胞率在各B(a)P各劑量水平均比

11、對照細(xì)胞的高，5μMB(a)P作用24小時，分別為對照細(xì)胞的2.74倍和2.61倍；4.HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2細(xì)胞的核芽雙核細(xì)胞率與B(a)P濃度呈正相關(guān)關(guān)系，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，5μM B(a)P作用24小時，分別為對照細(xì)胞的1.47倍、2.38倍、1.50倍和2.44倍。以上結(jié)果提示，DNA損傷修復(fù)基因缺陷損害了HBE細(xì)胞對B(a)P所致遺傳損傷的

12、修復(fù)能力。
　　 2.2.2彗星實驗結(jié)果
　　 彗星實驗結(jié)果表明，HBE-shGFP、HBE-shERCC1、HBE-shERCC2、HBE-shATM和HBE-shMSH2細(xì)胞的尾矩(tail moment,TM)與B(a)P濃度呈正相關(guān)關(guān)系，存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，5μMB(a)P作用24小時，分別為對照細(xì)胞的1.55倍、1.57倍、1.62倍和1.55倍。以上結(jié)果提示，DNA損傷修復(fù)基因缺陷損害了HBE細(xì)胞對B(a)P

13、所致遺傳損傷的修復(fù)能力。
　　 2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗
　　 2.3.1染毒濃度的確定
　　 本課題組前期研究已確定B(a)P對HBE細(xì)胞的IC50為80μM，HBE細(xì)胞B(a)P染毒濃度為5μM、10μM和20μM。
　　 2.3.2 HBEM和HBER細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗
　　 HBEV、HBEM和HBER細(xì)胞在軟瓊脂中的平均克隆形成數(shù)與B(a)P染毒劑量之間存在劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。在低劑量代謝活

14、化和連續(xù)染毒的條件下，20μM B(a)P誘導(dǎo)HBEM和HBER細(xì)胞轉(zhuǎn)化的時間分別為第12周和第8周，而HBEV于第14周仍未轉(zhuǎn)化。以上結(jié)果提示癌基因高表達(dá)明顯縮短細(xì)胞轉(zhuǎn)化間期，HBER比HBEM更敏感。
　　 2.3.3 DNA修復(fù)缺陷HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗
　　 各DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞在B(a)P連續(xù)作用20周后，均未能發(fā)生轉(zhuǎn)化。這表明以上幾種DNA修復(fù)缺陷細(xì)胞對B(a)P誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用不敏感。
　

15、　 3.結(jié)論
　　 3.1成功構(gòu)建了ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞株。這些所構(gòu)建細(xì)胞株在生長形態(tài)、錨著獨立性生長和細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性等生物學(xué)特性方面均未發(fā)生明顯改變。
　　 3.2 ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA損傷修復(fù)基因缺陷HBE細(xì)胞對B(a)P誘導(dǎo)的DNA損傷效應(yīng)敏感性增高。
　　 3.3 ERCC1、ERCC2、ATM和MSH2等DNA修復(fù)基因缺陷