室間隔缺損相關基因分析及超聲心動圖臨床應用研究.pdf

1、[目的]本研究通過收集VSD患者與正常人心室間隔心肌組織，應用SSH技術，得到正反差減cDNA文庫，從而獲取VSD與正常室間隔心肌細胞表達差異基因，分析VSD患者心肌組織基因表達譜系特征，分析出已知或未知表達差異基因的序列，篩選影響心肌細胞生長發(fā)育的相關基因，運用RT-PCR等技術進一步對部分差異表達基因進行表達水平的驗證，從而鑒定出可能與單純VSD發(fā)生有關的疾病相關基因。 [方法]1.提取VSD和正常人心室肌組織的總RNA和m

2、RNA。采用PCR-SelectcDNASubtractionKit試劑盒(Clontech公司，美國)，按照試劑盒說明書進行SSH：正向雜交以VSD患者心肌組織作為檢測子(tester)，正常人心肌組織作為驅趕子(driver)，以獲取在VSD患者心肌組織中高表達的相關基因；反向雜交則以正常人心肌組織作為檢測子，VSD患者心肌組織作為驅趕子，以獲取在正常人心肌組織中高表達的相關基因。采用含特殊引物G3PDH的PCR擴增循環(huán)的不同，來驗

3、證差減cDNA文庫的差減效率。 2.將正向、反向SSH獲得的第二次PCR產(chǎn)物插入pGEM-TEasyVector(Promega公司，美國)中，并轉化至EscherichiacolistrainXL2-BlueMRF'UltracompetentCells(Stratagene公司，美國)內構建cDNA差減文庫。成功克隆后進行全自動測序分析。測序結果用Blastn(BasicLocalAlignmentSearchTool)與N

4、CBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的GenBank進行“核苷酸序列關于核酸序列數(shù)據(jù)庫的同源性檢索”，取最高同源性檢索結果。95﹪以上一致性的序列認為是同源序列。 3.隨機挑選部分差異表達基因進行表達水平的RT-PCR驗證，以GAPDH基因為內參照。[結果]1.可見未雜交的cDNA在23個擴增循環(huán)后即出現(xiàn)明顯的條帶，而雜交的cDNA在33個擴增循環(huán)后才出現(xiàn)明顯的條帶，雜交后

5、G3PDH的含量明顯減低，這就證明了差減cDNA文庫具有高的差減效率。 2.獲得1378條質量較好的序列，經(jīng)與NCBI的Genbank中的非冗余基因序列比較，發(fā)現(xiàn)551條序列對應于已知基因(95﹪以上一致性的序列認為是同源序列)，87條為未知EST序列，還有73條僅對應于基因組DNA序列。在551條已知基因中，299條基因在VSD患者心肌組織中高表達，而252條基因在正常人心肌組織中高表達。進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)，已知差異表達

6、基因與能量代謝、細胞周期和生長、細胞骨架和細胞黏附、LIM蛋白、鋅指蛋白以及發(fā)育等有關。 3.RT-PCR驗證結果與SSH所得的結果相似，進一步驗證了本SSH實驗的假陽性率較低。 [結論]1.差減cDNA文庫具有高的差減效率。本SSH實驗的假陽性率較低。 2.通過SSH實驗獲得1378條序列，其中551條序列對應于已知基因。這些已知差異表達基因與能量代謝、細胞周期和生長、細胞骨架和細胞黏附、LIM蛋白、鋅指蛋白以

7、及發(fā)育等有關。 第二部分超聲心動圖在室間隔缺損介入封堵術中的應用 [背景]隨著介入技術的不斷完善和進步，先天性心臟病的介入治療的適應證已從動脈導管未閉、房間隔缺損及肌部VSD，發(fā)展到目前的膜周部VSD。超聲心動圖以其實時、無創(chuàng)、高質量的圖像及血流顯像及重復性強、檢查方便、費用低廉等其他檢查無可比擬的優(yōu)點，不但能在術前篩選、確診病人的疾病類型，確定手術及治療方法、時間，在術中提供準確的監(jiān)測結果及數(shù)據(jù)，引導介入治療，更能即刻

8、判定治療效果及定期長時間、多次隨訪病人，觀察術后心臟結構、功能、血流動力學變化及合并癥，在心臟介入治療中發(fā)揮著越來越重要甚至是必須的、不可替代的作用。VSD患者常常合并膜部瘤的形成，是VSD自然閉合過程中并發(fā)的征象，而膜部瘤的形態(tài)呈現(xiàn)多樣性，此類患者在介入治療適應證和方法的選擇上各有不同。因此術前對于膜部瘤的檢出及對膜部瘤形態(tài)的正確評估，對于提高VSD介入封堵術的成功率就顯得尤為重要。VSD患者經(jīng)外科修補或經(jīng)導管封堵后，均有可能發(fā)生各種

9、心律失常，嚴重者可危及生命，因此，在術前對VSD缺損位置進行研究，找出其與封堵術后產(chǎn)生心律失常之間的關系，對于臨床預防或及時治療封堵術后發(fā)生的嚴重心律失常將具有重要的意義。 [目的]選擇我院行經(jīng)導管膜周部VSD封堵術的患者186例，采用經(jīng)胸超聲心動圖(TransthoracicEchocardiography，TTE)進行封堵術前患者的篩選，術中封堵器放置的引導和監(jiān)測以及術后心臟結構、功能及血流動力學變化的隨訪，探討TTE在經(jīng)導

10、管膜周部VSD封堵術中的應用價值；探討TTE檢查對室間隔膜部瘤的檢出比例及不同形態(tài)的膜部瘤對于經(jīng)導管堵閉VSD技術成功率的影響；初步探討TTE術前評價VSD缺損位置，對預測封堵術后心律失常發(fā)生的作用。 [方法]1.選擇2002年06月至2006年1月，在我院行經(jīng)導管治療的膜周部VSD患者186例，采用HP-5500型或GE-VIVID-7型彩色多普勒診斷儀，超聲探頭頻率為2.5～5MHz。 2.所有患者術前均行TTE進行

11、篩選。仔細觀察VSD是否合并膜部瘤，對形成的膜部瘤進行形態(tài)學的分類；測量VSD的大小(Dvsd)、缺損距離主動脈瓣右冠瓣環(huán)(Dao)及三尖瓣隔瓣(Dtv)的距離、左心房(LA)大小、左心室腔(LVDd/LVDs)大小、左心室收縮功能(EF)、二尖瓣血流速度(Em、Am、Em/Am)、左心室流出道血流速度(Ⅴ)、左心室游離壁、室間隔和右心室游離壁靠近房室瓣瓣環(huán)心室肌組織的最大位移(D)、收縮期峰值速度(S)、舒張早期峰值速度(E)和舒張晚

12、期峰值速度(A)等。術中采用TTE進行引導和監(jiān)測。分別于術后1周、1月進行超聲檢查復查上述指標。 3.所有患者術前均行ECG檢查，術后每日ECG檢查至少1次以了解心律失常的發(fā)生情況。 [結果]1.由TTE進行術前篩選的病例最終可成功進行封堵的比例為了93﹪。TTE在術中可清晰地顯示導絲、鞘管和封堵器的位置。 2.VSD殘端距主動脈瓣右冠瓣瓣環(huán)的距離，超聲測值明顯小于術中X線測值，兩者間存在統(tǒng)計學差異P＜0.001

13、。 3.封堵術后1周內LA、LVDd、EF即明顯減?。籈m、Am以及Em/Am明顯降低；左心室流出道血流速度增快；左心室游離壁和室間隔的最大位移(D左和D中)明顯減小，S在三個室壁均無變化；E在三個室壁均顯示為降低，但A及E/A值并沒有明顯改變。 4.術前超聲檢查顯示162例膜周部VSD患者中有127例有膜部瘤形成，與左心室造影顯示126例存在膜部瘤相比，檢出比例無顯著性差異(P＞0.05)。根據(jù)超聲心動圖表現(xiàn)將室間隔膜

14、部瘤分為漏斗型(Ⅰ型)、隧道型(Ⅱ型)、瘤型(Ⅲ型)和蕈傘型(Ⅳ型)四種類型。其中Ⅲ型基底部距離主動脈瓣瓣環(huán)超過1mm者為ⅢA型，小于1mm者為ⅢB型；Ⅳ型膜部瘤者其右室面1個破口時為ⅣA型，具有2個以上破口時為ⅣB型。 5.127例具有膜部瘤的患者中有118例成功進行了VSD封堵，總堵閉成功率為92.9﹪，其中Ⅰ、Ⅱ、ⅢA和ⅣA型膜部瘤的VSD堵閉成功率為100﹪；ⅢB和ⅣB型堵閉成功率分別為77.8﹪和82.1﹪。

15、6.172例進行VSD封堵患者，術后1周內發(fā)生心律失常70例次(40.7﹪)，其中房室傳導阻滯10例次(5.8﹪)；束支阻滯35例次(20.3﹪)；室性心動過速14例次(8.1﹪)(包括室性心動過速和加速性室性自主心律)；加速性交界性心動過速11例次(6.4﹪)。嚴重心律失常(Ⅲ度房室傳導阻滯)4例次(2.3﹪)。 7.采用多因素非條件Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，房室傳導阻滯的發(fā)生與Dtv及封堵器大小相關；束支阻滯的發(fā)生與Da

16、o及封堵器大小相關；室性心動過速的發(fā)生與Dao、封堵器大小及患者年齡相關；加速性交界性心動過速的發(fā)生與患者年齡相關。 8.發(fā)生房室傳導阻滯的10例患者中，Dtv小于2.77mm者有7例(70﹪)；發(fā)生束支阻滯的35例患者中，Dao大于2.82mm或Dao小于2.35mm者各有17例(48.6﹪)；而發(fā)生室性心動過速的14例患者中，Dao大于2.82mm者占8例(57.1﹪)。9.對于小于10歲、10歲至30歲及大于30歲三組VS

17、D患者，封堵術后，房室傳導阻滯的發(fā)生率分別為8﹪、2.8﹪和8.3﹪；束支阻滯的發(fā)生率分別為23.9﹪、9.7﹪和58.3﹪；室性心動過速在的發(fā)生率分別為2.3﹪、12.5﹪和25﹪；加速性交界性心動過速的發(fā)生率分別為3.4﹪、4.2﹪和41.7﹪。 [結論]1.TTE有利于術前選擇合適的VSD封堵術患者，術中引導封堵器的放置，術后檢測有無殘余分流，對了解心臟結構、功能及血流動力學的改變具有重要作用。 2.TTE測量VS