膜聯(lián)蛋白B2的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、膜聯(lián)蛋白(annexin)家族是在真核生物中廣泛存在，具有重要生理功能的一類(lèi)鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白。因其在Ca2+存在的情況下能夠和酸性磷脂結(jié)合，所以又稱為鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白。膜聯(lián)蛋白B2(AnxB2)是本實(shí)驗(yàn)室從豬囊尾蚴cDNA文庫(kù)中篩選得到的一個(gè)新的膜聯(lián)蛋白B家族成員。它具有四個(gè)典型的annexin重復(fù)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)"G-X-G-T-(38 residues)-D/E"基序，形成4個(gè)typeⅡ型Ca2+結(jié)合位點(diǎn)；經(jīng)生物信

2、息學(xué)分析可知，AnxB2分子結(jié)構(gòu)中包含15個(gè)抗原表位；AnxB2在Ⅱ和Ⅲ結(jié)構(gòu)域之間存在2個(gè)獨(dú)特的“插入片段”和一個(gè)“賴氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(KGD)”序列并且AnxB2還具有一個(gè)獨(dú)特的粘多糖附著位點(diǎn)(G-AS)。我們根據(jù)AnxB2已有的結(jié)構(gòu)特征來(lái)研究AnxB2的生物功能，為AnxB2功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 本課題的研究分為三個(gè)方面： 1、從豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴中克隆出AnxB2基因，證明AnxB2在六鉤蚴階段表達(dá)。接著借

3、助計(jì)算機(jī)同源模建技術(shù)構(gòu)建了4個(gè)AnxB2突變體M234，M134，M124，M123。用基因重組技術(shù)將AnxB2及其突變體分別構(gòu)建到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，并用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果表明構(gòu)建的真核質(zhì)粒能夠表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白；同時(shí)也構(gòu)建了AnxB2突變體的原核表達(dá)載體并用親和層析技術(shù)純化相關(guān)蛋白。另外，利用膜聯(lián)蛋白的鈣依賴性磷脂結(jié)合活性構(gòu)建的pJLA503-AnxB2表達(dá)載體使AnxB2在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高表

4、達(dá)；接著采用鈣離子介導(dǎo)的沉淀反應(yīng)來(lái)初步純化重組蛋白；隨后用離子交換層析技術(shù)進(jìn)一步純化蛋白。用改良的純化方法，我們制備出高純度和高生物活性的AnxB2。 2、對(duì)AnxB2進(jìn)行免疫學(xué)方面的研究。將真核表達(dá)質(zhì)粒分別免疫BALB/c純系鼠，以間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清的抗體應(yīng)答水平；淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫動(dòng)物CD4+T細(xì)胞的活化狀態(tài)；淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果表明，免疫注射的DNA疫苗雖然均能誘導(dǎo)Th

5、1型免疫應(yīng)答反應(yīng)，但是它們誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平不同：pcDNA3.1-M234組誘導(dǎo)的抗體水平最低和pcDNA3.1-M123組分泌的IFN-γ水平最低：“DNA prime-protein boost”組誘導(dǎo)的抗體水平和分泌的IFN-γ水平最高。根據(jù)結(jié)果，我們可以推斷：M234缺失的抗原表位為B細(xì)胞表位，而M123缺失的表位是T細(xì)胞表位；“DNA prime-protein boost”策略可有效增強(qiáng)機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答。

6、 3、對(duì)AnxB2進(jìn)行抗凝血活性方面的研究。結(jié)果表明：AnxB2具有外源性抗凝血活性；與活化血小板結(jié)合的能力更強(qiáng)(versus AnxB1)。從結(jié)果我們可知，用改良的純化方法制備的AnxB2保留了原來(lái)的生物活性，驗(yàn)證了這種純化方法的可行性。隨后對(duì)AnxB2突變體M123、M234進(jìn)行抗凝血活性和免疫原性研究。結(jié)果表明，M234不僅較好的保留了野生型AnxB2的抗凝血活性，而且免疫原性降低，這為進(jìn)一步研究膜聯(lián)蛋白AnxB2的抗凝血功能和