膜聯(lián)蛋白B1的晶體結(jié)構(gòu)研究及其在生物學(xué)上的應(yīng)用.pdf

1、膜聯(lián)蛋白(Annexin)家族是一群結(jié)構(gòu)相似的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,廣泛存在于動植物的各個(gè)組織器官,并且含量豐富。膜聯(lián)蛋白B1是本課題組從豬囊尾蚴(Cysticercus cellulosae)cDNA文庫中篩選得到的一個(gè)新的膜聯(lián)蛋白亞家族成員。同源模建顯示膜聯(lián)蛋白B1的三維結(jié)構(gòu)與膜聯(lián)蛋白A5最為接近,兩者的氨基酸序列比較結(jié)果顯示同源性為36％,其差異主要體現(xiàn)在N末端和170-240位氨基酸處。膜聯(lián)蛋白B1具有很強(qiáng)的抗凝血活性,并

2、能與活化血小板結(jié)合使其在凝血過程中具有靶向性；另外,它還具有鈣依賴性的肝素結(jié)合活性,以及抑制胞質(zhì)中磷脂酶A2的活性。本課題的研究主要分為以下三個(gè)方面： (1)膜聯(lián)蛋白B1的晶體結(jié)構(gòu)研究:pJLAS03表達(dá)天然的及硒代甲硫氨酸的膜聯(lián)蛋白B1,利用Q-FF離子交換層析、Phenyl疏水層析及S200分子篩純化后,目的蛋白純度達(dá)到99％以上。蛋白溶液濃縮后以30mg/ml的濃度,利用Hampton Research的方法結(jié)晶。最后經(jīng)優(yōu)

3、化的晶體X射線衍射的結(jié)果為1.7A。HKL2000初步解析得到空間群為P213。 (2)表達(dá)純化系統(tǒng)的構(gòu)建：將膜聯(lián)蛋白B1與內(nèi)含肽作為融合標(biāo)簽構(gòu)建了表達(dá)載體pAnxB1,然后將單鏈尿激酶(single-chain urokinase,ScuPA)基因和人白介素2基因克隆到載體上。利用膜聯(lián)蛋白B1的鈣離子結(jié)合活性純化目的蛋白,利用內(nèi)含肽的自剪接活性去除融合標(biāo)簽,并對純化后的目的蛋白進(jìn)行生物學(xué)活性檢測。整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該純化系統(tǒng)是

4、可行的。 (3)雙靶向溶栓藥的構(gòu)建：利用膜聯(lián)蛋白B1的活性血小板靶向性和抗凝血活性,將它與單鏈尿激酶(single-chain urokinase,ScuPA)及纖維蛋白黏附肽(fibrin adherent peptide)融合表達(dá),構(gòu)建了新型的雙靶向溶栓藥物。體外實(shí)驗(yàn)及動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該雙靶向溶栓藥溶栓效果顯著、活性血小板靶向性好、出血量低等。與膜聯(lián)蛋白A5構(gòu)建的溶栓藥相比,該藥的纖維蛋白溶解活性與其類似,抗凝活性及血小板靶