斜帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒B2蛋白的功能研究.pdf

1、神經(jīng)壞死病毒是養(yǎng)殖魚類的重要病原之一，能引起腦和視網(wǎng)膜壞死的病毒性神經(jīng)壞死癥(VNN)，在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖魚類危害很大，尤其在魚類育苗期威脅極大，能造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。斜帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒(OGNNV)是β諾達(dá)病毒屬的一員，人們對(duì)其基因組和蛋白質(zhì)組的研究暫時(shí)還較少。2004年本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得OGNNV的基因組序列并預(yù)測(cè)具有B2多功能蛋白。本論文將鑒定OGNNV增殖過(guò)程中B2蛋白的存在，并對(duì)B2基因進(jìn)行原核和真核表達(dá)，對(duì)其凋亡和結(jié)合核酸

2、等功能進(jìn)行初步研究。 首先用生物學(xué)軟件對(duì)B2基因及其蛋白產(chǎn)物進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析其進(jìn)化地位，結(jié)果與MCP基因的分析一致。根據(jù)基因組序列，將B2基因克隆至pQE30載體中進(jìn)行原核表達(dá)，表達(dá)的His-B2融合蛋白經(jīng)親和層析和電泳分離雙重純化后，免疫小鼠制備了B2蛋白的多克隆抗體，抗血清效價(jià)達(dá)到1：8000以上。以該抗體運(yùn)用Western blot鑒定了野生型OGNNV在增殖過(guò)程中確實(shí)表達(dá)了B2蛋白。 以O(shè)GN

3、NV感染SSN-1細(xì)胞后，通過(guò)觀察細(xì)胞病理變化、Western blot檢測(cè)病毒蛋白的表達(dá)確證了OGNNV的感染。同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)病毒感染后各個(gè)時(shí)間段OGNNV全部基因(mcp．RdRp、B2)的表達(dá)變化。MCP基因在感染24小時(shí)后表達(dá)迅速上升，RdRp和B2基因在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平相當(dāng)，增加趨勢(shì)一致，也支持了表達(dá)B2的RNA3來(lái)源于RNA1的觀點(diǎn)。 為研究B2蛋白結(jié)合核酸的能力，將B2基因克隆至pGEX—4T-1

4、，并進(jìn)行融合表達(dá)和親和層析純化GST—B2蛋白。利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GST—B2蛋白能夠結(jié)合20 bp以上的雙鏈RNA，且片段越長(zhǎng)結(jié)合效率越高。在保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，GST—B2蛋白能結(jié)合不同序列的雙鏈RNA，證明這種結(jié)合沒(méi)有序列依賴性，能保護(hù)長(zhǎng)鏈的雙鏈RNA免受Dicer酶的切割消化。表明在病毒增殖過(guò)程中，B2蛋白在保護(hù)病毒RNA免受宿主核酸酶攻擊方面扮演重要角色。 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位與功能相關(guān)，因此構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcB2-GFP和