半夏變異類型的HPLC及ISSR指紋圖譜分析.pdf

1、本文對半夏生藥學、化學成分、藥理活性及毒性的研究進展作一綜述，為后續(xù)研究提供參考；對不同變異類型半夏的鳥苷含量、HPLC指紋圖譜、ISSR指紋圖譜進行研究，為進一步選育優(yōu)良種質(zhì)、引種及規(guī)范化種植提供依據(jù)。本實驗主要得到以下結(jié)果： 1．鳥苷含量的測定 采用反相高效液相色譜法，以甲醇—水—醋酸(5：95：0.01)為流動相，檢測波長254nm，柱溫為25℃，流速1.0ml/min，對半夏不同栽培類型中鳥苷的含量進行測定，含量

2、在0.0114～0.155％之間，其中單葉半夏中鳥苷含量最高，為0.155％，其次是雙珠芽半夏，為0.150％。該方法可用于半夏藥材中鳥苷的含量測定。 2．HPLC指紋圖譜的研究 建立了半夏不同栽培類型高效液相色譜指紋圖譜的研究方法。確定了指紋圖潛的測定條件，色譜柱：cosmosilODS(4.6mm×250 mm，5μm)；流動相：A色譜甲醇，B純水；線性梯度洗脫：0.01-5 min100％B，5-15 min100

3、％-97％B，15-25 min97％-95％B；流速：1.0 ml/min；檢測波長：54 nm；柱溫：25℃；進樣量：20μL。通過分析指紋圖潛，確定了11個峰為半夏藥材指紋圖譜的共有峰，構(gòu)成該藥材特有的色譜指紋圖譜特征，以4號峰為參照物，對其他色譜峰的相對保留時間和相對峰面積進行計算，作為技術參數(shù)評價指紋圖譜。通過對指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)進行聚類分析，可以將不同變異類型半夏進行判別分類。HPLC指紋圖譜可以用于較全面地考察半夏藥材的質(zhì)

4、量。 3．ISSR指紋圖譜的研究 (1)半夏ISSR反應體系的建立 采用改良CTAB法提取半夏基因組DNA，經(jīng)A260和A280比值的測定，以及電泳檢測和PCR擴增，表明改良CTAB法所提取的DNA在純度、完整性都較好。建市了半夏最佳ISSR反應體系：25μL反應體系中含2.5μL10×buffer、2.0 mmol/L，MgCl2、0.4mmol/L dNTPs、25ng模板DNA、0.5U Taq DNA聚合

5、酶。最佳反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性50s，41℃-51.2℃(退火溫度隨引物不同而定)50s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)39次，72℃最后延伸5min，4℃保存。 (2)半夏種質(zhì)資源遺傳多樣性分析 從50條ISSR引物中篩選出擴增條帶清晰，穩(wěn)定性好的5條引物。共擴增出41個位點，平均每個引物擴增出8條，DNA片段大小分布在0.2-3.0kb之間。不同引物擴增的多態(tài)性也存在較大的差異，擴增的多態(tài)性條帶