磺胺甲噁唑單抗的制備及初步應用.pdf

1、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole，SMZ)，在獸醫(yī)臨床上主要用于呼吸道和泌尿道感染。其與抗菌增效劑甲氧芐氨嘧啶(TMP)聯合應用藥物復方新諾明，具有抗菌譜廣、療效確切、性質穩(wěn)定、使用方便、價格低廉、國內能大量生產等諸多優(yōu)點，使得它成為目前獸醫(yī)臨床上磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)中應用最廣泛的抗菌藥物之一。與此同時，濫用、濫添加于動物和動物飼料中的事件屢見不鮮，最終導致其在動物性產品中殘留過高，這不僅對動物本身

2、有很大的毒副作用，也對人類健康產生極大的損害!許多國家和組織規(guī)定了磺胺類藥物的最高殘留限量(Maximum Residues Limits，MRL)，韓國、美國、歐共體(EEC)、以及在國際食品法典委員會(CAC)下設立的食品中獸藥殘留法典委員會(CCRVDF)等都規(guī)定了磺胺類總量和或具體單個磺胺類藥物的含量不得超過0.1mg/kg，日本更是對個別磺胺類藥物規(guī)定不得檢出。因此，開發(fā)和建立高效、準確、低廉的磺胺類藥檢測方法具有極其重要的現

3、實意義。 目前，關于磺胺類藥物的檢測方法主要有傳統(tǒng)方法，包括微生物學測定法、滴定法、分光光度法等；色譜技術，包括氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣/液-質聯用(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、超臨界流體色譜技術(SFC)等；免疫學分析法，包括酶聯免疫吸附法(EIASA)、熒光免疫測定法(FLA)、膠體金免疫測定法(CGIA)、免疫傳感器(IB)等。傳統(tǒng)方法靈敏度不高，特異性不強，易被其它物質干擾，且分析時間

4、較長；色譜技術雖然靈敏度高，但檢測儀器化程度高，設備昂貴，操作技術要求高，前處理要求高；免疫學方法特異性強、靈敏度高、前處理簡單、操作簡便、易推廣使用，其中酶聯免疫吸附法同時可檢測多個樣品，特異性強、靈敏度高、速度快，是一個準確性、安全性高、實用性強的檢測技術。 本研究運用化學合成方法制備SMZ完全抗原，采用單克隆抗體技術制備靈敏度高、特異性強、效價高的單抗，建立了ELISA測定方法，并初步應用于豬肉、雞蛋、蜂蜜和牛奶中SMZ藥

5、物的檢測。 由于磺胺甲噁唑分子量很小，僅為253.28，為半抗原。本研究利用磺胺甲噁唑具有的伯氨基結構，通過重氮法將其與載體蛋白HSA和BSA偶聯，制備的兩種人工抗原偶聯比分別為：23:l和21:1。用SMZ-BSA免疫7周齡BALB/c雌性小鼠后，融合前血清效價已達1:400,000以上。利用單克隆抗體技術和現代細胞融合技術，經過篩選，獲得兩株單克隆抗體雜交瘤細胞株3G11和2H10，穩(wěn)定性實驗表明，這兩株單抗細胞株可穩(wěn)定地分

6、泌抗SMZ單克隆抗體。 通過建立間接競爭ELISA方法，測定腹水最佳工作濃度在1:1×106以上。用3G11制備的腹水作出的SMZ藥物抑制標準曲線，其線性方程為：y=0.206x-0.0317(R2=0.9885)，LOD為3.29ng/ml，LOQ為23.06ng/ml。通過對同類藥物以及兩種非磺胺類藥物的交叉反應實驗表明該SMZ單抗的特異性良好，對其他藥物的抑制率均小于10％。 另外，本研究對應用磺胺甲嗯唑較多的動物

7、性食品進行了添加回收試驗。對樣品處理方法進行了優(yōu)化。測得在牛奶中藥物添加回收率為98.9％～129.1％，在蛋黃、蛋清以及全蛋中的添加回收率分別為78.7％～102.3％、71.9％～85.3％和78.7％～102.3％，在豬肉中的添加回收率為89.7％～116.2％，在蜂蜜中的添加回收率為74％～111.7％。試驗表明本實驗所制備的磺胺甲噁唑單克隆抗體可用于對于動物性食品中磺胺甲噁唑殘留的檢測，為磺胺甲噁唑殘留酶聯免疫快速檢測試劑盒或