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文檔簡介
1、結核?。═uberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)所致的以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病,也是現(xiàn)今全世界范圍內最重要的致病和致死因素之一。據(jù)WHO估計,目前全世界約有1/3人口處于MTB感染狀態(tài),我國TB患者數(shù)量居世界第二位,感染人數(shù)已達4億。這部分人中只有10%可能最終發(fā)展成為活動性TB,而絕大多數(shù)為隱性感染,感染的細菌以休眠菌的形式存在。這種休眠菌耐藥性極強,可在體內
2、長期存在,常規(guī)方法難于分離培養(yǎng)。卡介苗(BacilleCalmette-Guerin,BCG)是MTB的減毒株,是目前唯一用于TB預防的疫苗,但其對隱性感染者無效,還存在保護期短,免疫應答較弱等缺陷。因此,研究MTB的致病及免疫機制,研制更為有效的診斷、治療和預防MTB感染,特別是針對隱性感染的新方法、新措施及新疫苗等具有重要意義。
近年來研究發(fā)現(xiàn),在MTB休眠菌的復蘇過程中,MTB分泌的5種促進復活因子(Resuscitat
3、ion promoting factor,Rpf)起了重要作用,分別為Rv0867c(RpfA),Rv1009(RpfB),Rv1884c(RpfC),Rv2389c(RpfD)和Rv2450c(RpfE)。Rpf最早在藤黃微球菌(Micrococcusluteus,M.luteus)中發(fā)現(xiàn)。通過同源性分析發(fā)現(xiàn),Rpf存在于多種富含G+C的革蘭陽性細菌中,其基因編碼的蛋白均具有Rpf樣結構域。在研究中發(fā)現(xiàn),Rpf蛋白的結構域與完整Rpf
4、蛋白具有一致的生物學特性。對Rpf家族的研究還發(fā)現(xiàn),Rpf樣蛋白不僅與細菌的增殖有關,還可能是宿主免疫系統(tǒng)識別的靶抗原。
在本研究中,我們分別克隆、表達和純化了藤黃微球菌Rpf蛋白、Rpf結構域蛋白、RpfB結構域蛋白;制備了抗藤黃微球菌Rpf結構域和抗RpfB結構域的單克隆抗體(monoclonalantibody,Mab);研究了藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白的生物學功能和免疫學特性。評價其用于MTB分
5、離培養(yǎng)添加劑、相關抗原檢測方法建立及TB新型疫苗研制的可能性。
實驗目的:利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白;制備抗藤黃微球菌Rpf結構域、抗RpfB結構域的Mab;進一步研究其生物學功能和免疫學特性。
實驗方法和結果:
1.藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的克隆、表達與純化
采用PCR方法分別從藤黃微球菌和MTBH37Rv的基因組中分別
6、擴增出相應大小的藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域目的基因片段,并分別克隆入pUC-19載體中測序,結果與GenBank報道的完全一致。將目的基因分別克隆人pProEXHTb表達載體中,酶切鑒定后,分別在E.coli中由IPTG誘導表達目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE分析,表達的3種目的蛋白與預期分子量一致;Western-blot分析表明3種融合6×His的目的蛋白均可與抗6×HisMAb特異反應。3種目的蛋白均以包涵體的形式
7、表達,用親和色譜法在變性條件下分別純化3種目的蛋白。
2.藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的生物學功能研究
2.1抗藤黃微球菌Rpf結構域、抗RpfB結構域Mab的制備及鑒定
用藤黃微球菌Rpf結構域蛋白分別免疫BALB/c小鼠,進行細胞融合,獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗藤黃微球菌Rpf結構域Mab的雜交瘤細胞系,分別命名為F3D10、G10D5、G6C8,其中F3D10、G10D5為IgG1亞類,
8、G6C8為IgM亞類,其相對親和力為F3D10>G6C8>G10D5;用RpfB結構域蛋白免疫BALB/c小鼠,進行細胞融合,獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗RpfB結構域Mab的雜交瘤細胞系,分別命名為D3A5、B8G11、A9C8,其中D3A5、B8G11為IgG1亞類,A9C8為IgM亞類,其相對親和力為A9C8>D3A5>B8G11。
分別構建了pcDNA3.1(-)-Rpf結構域及pcDNA3.1(-)-RpfB結構域真核表達
9、載體,轉染COS-7細胞,用間接免疫熒光法檢測表明藤黃微球菌Rpf結構域蛋白和RpfB結構域蛋白在COS-7細胞中有表達,也間接驗證了Mab的特異性。
2.2抗藤黃微球菌Rpf結構域及抗RpfB結構域Mab的交叉實驗。
分別用藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域、RpfB結構域、RpfA(本實驗室純化的MTBRpfA蛋白,質粒為國外MikeYoung教授饋贈)及H37Ra作為抗原與制備的兩種Mab反應,結果顯示:兩種抗結構
10、域Mab均可以與以上蛋白和H37Ra菌株發(fā)生反應。
2.3藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白促藤黃微球菌及MTBH37Ra休眠菌的復蘇和生長作用
取藤黃微球菌和MTBH37Ra的休眠菌適當稀釋后,隨機分為3組。每組分別加入不同稀釋濃度的純化蛋白及相應的抗結構域Mab,取不同時間點的培養(yǎng)液測OD600值,繪制生長曲線。結果顯示:當藤黃微球菌Rpf和Rpf結構域濃度均為100pmol/L時,刺激藤黃微球菌
11、復蘇和生長作用明顯,當藤黃微球菌Rpf濃度為10pmol/L、Rpf結構域濃度為100pmol/L時,刺激MTBH37Ra復蘇和生長作用明顯,而且這種刺激作用在加入了1:600的抗藤黃微球菌Rpf結構域Mab后明顯被抑制;當RpfB結構域濃度為1000pmol/L時,刺激藤黃微球菌復蘇和生長作用明顯,當RpfB結構域濃度為500pmol/L時,刺激MTBH37Ra復蘇和生長作用明顯,而且這種刺激作用在加入了1:1000的抗RpfB結構域
12、Mab后明顯被抑制。
3.藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域的免疫學特性研究
采用皮下包埋的方法,分別將藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白滴到硝酸纖維素膜小塊上,免疫小鼠3次,每次間隔2周,同時設BCG免疫組和生理鹽水對照組。用ELISA方法檢測免疫小鼠血清中的特異性抗體平均滴度。結果顯示:藤黃微球菌Rpf蛋白免疫組最高抗體效價為1:12800,藤黃微球菌Rpf結構域蛋白免疫組最高抗體效價
13、為1:4800,RpfB結構域蛋白免疫組最高抗體效價為1:6400。
為了檢測蛋白免疫小鼠引起的細胞免疫應答,最后一次免疫完成兩周后,分離各免疫組小鼠脾淋巴細胞,在體外經(jīng)PPD刺激后,MTT法檢測淋巴細胞增殖反應,藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白免疫小鼠后的刺激指數(shù)分別為:2.86±0.12,2.10±0.09,2.40±0.11,明顯高于生理鹽水對照組(0.90±0.21)(P<0.01),但不及BCG免疫
14、組(3.50±0.23)(P<0.05)。藤黃微球菌Rpf蛋白誘導產(chǎn)生的IFN-γ,IL-10和IL-12平均水平分別為1528±36ng/L,485±13ng/L和302±14ng/L;藤黃微球菌Rpf結構域蛋白誘導產(chǎn)生的IFN-γ,IL-10和IL-12平均水平分別為1126±36ng/L,368±13ng/L和289±14ng/L;RpfB結構域蛋白誘導產(chǎn)生的IFN-γ,IL-10和IL-12平均水平分別為1432±30ng/L,
15、503±11ng/L和311±11ng/L;BCG免疫組誘導產(chǎn)生的IFN-γ,IL-10和IL-12平均水平分別為2022±38ng/L,578±13ng/L和400±10ng/L;生理鹽水對照組IFN-γ,IL-10和IL-12水平分別為256±6ng/L,76±3ng/L和56±4ng/L。從結果可以看出,3種蛋白免疫小鼠后誘導產(chǎn)生的細胞因子水平明顯高于生理鹽水對照組(p<0.01),但不及BCG免疫組(p<0.05)。
16、免疫完成后第四周,用105CFUMTBH37Rv毒株經(jīng)尾靜脈攻擊上述各免疫組小鼠,計數(shù)脾臟細菌負荷數(shù)。與生理鹽水對照組相比,藤黃微球菌Rpf、Rpf結構域和RpfB結構域蛋白免疫組小鼠對H37Rv毒株攻擊后MTB在脾臟中的增殖均有顯著抑制作用(差值分別為1.89log10、1.61log10和1.78log10)(p<0.05),但不如BCG免疫組(差值為2.83log10)(p<0.05)。
結論:藤黃微球菌Rpf、Rpf結
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