REV gp90蛋白的表達(dá)及部分免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）引起的雞、鴨、火雞及其他禽類(lèi)的一群病理綜合征。REV屬反轉(zhuǎn)錄病毒，感染后可導(dǎo)致禽類(lèi)生長(zhǎng)遲緩、形成慢性腫瘤等，還可損傷禽類(lèi)免疫器官，造成機(jī)體免疫功能下降，從而導(dǎo)致免疫失敗，極易繼發(fā)感染其他疾病。REV所引起的網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥在英國(guó)、德國(guó)、澳大利亞等均有報(bào)道，該病在我國(guó)的流行呈逐漸擴(kuò)大趨勢(shì)，我國(guó)家禽感染REV已達(dá)20

2、％-30%。給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)的損失越來(lái)越嚴(yán)重。
　　REV的基因組結(jié)構(gòu)為單鏈線性RNA，含有g(shù)ag、pol、env基因，env基因編碼的是gp90蛋白和gp20蛋白，gp90蛋白屬于REV囊膜蛋白，是REV的免疫原性蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。因此，體外獲得gp90蛋白，研究其免疫學(xué)特性，對(duì)探索REV的致病機(jī)制及該病的預(yù)防、診斷具有重要意義。
　　方法：
　　本試驗(yàn)通過(guò)選擇pET-22b

3、(+)及pET-30a(+)兩種載體，針對(duì)gp90全基因設(shè)計(jì)引物，并在兩端添加EcoR I和Xho I限制性?xún)?nèi)切酶，以pMD-19T-gp90重組菌基因組為模板，擴(kuò)增gp90基因。將目的基因與載體pET-22b(+)及pET-30a(+)同時(shí)進(jìn)行EcoR I和XhoI雙酶切，經(jīng)純化回收后，將目的基因克隆至pET-22b(+)及pET-30a(+)載體上，構(gòu)建重組載體pET-22b(+)-gp90及pET-30a(+)-gp90，然后分別

4、轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)PCR鑒定及雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果運(yùn)用 blast軟件進(jìn)行比對(duì)分析，觀察有無(wú)基因突變。將pET-22b(+)-gp90及pET-30a(+)-gp90重組陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，使用PCR法及雙酶切法鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，鑒定無(wú)誤后再次進(jìn)行核苷酸序列測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，再次檢查基因序列是否與原序列一致。采用IPTG對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使用SD

5、S-PAGE法及western-blot法鑒定目的蛋白表達(dá)情況及表達(dá)形式、反應(yīng)原性。對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，制備雞抗gp90血清，將免疫的雞分別在21、28、35、42天采血收集血清，ELISA檢測(cè)其抗體效價(jià)。雞免疫42天時(shí)處死，制備脾臟淋巴細(xì)胞，檢測(cè)gp90抗原體外刺激后分泌的細(xì)胞因子水平（IFN-γ、IL-4），分析細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)果：
　　1.成功擴(kuò)增 gp90基因并構(gòu)建重組克隆載體 pET-22b(+)-gp90及

6、pET-30a(+)-gp90，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，當(dāng)溫度為37℃，IPTG濃度為1mM時(shí)，E.coli BL21-pET-22b(+)-gp90及E.coli BL21-pET-30a(+)-gp90有目的蛋白表達(dá)，且大小與預(yù)期的一致，而當(dāng)30℃時(shí)無(wú)目的蛋白表達(dá)；Western-blot法檢測(cè)表明目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。
　　2.對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果表明，gp90重組蛋白能較好的被純化出來(lái)。且純化后的目的蛋白純度達(dá)到95%以上

7、；ELISA方法檢測(cè)gp90抗血清的效價(jià)為12500 EU。且gp90抗血清在免疫的第42d抗體效價(jià)達(dá)到最高。
　　3.細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，gp90刺激產(chǎn)生 IFN-γ、IL-4的濃度分別為114.56pg/mL、68.76 pg/mL，均明顯高于PBS陰性對(duì)照組，表明gp90能夠刺激雞產(chǎn)生較高水平的IFN-γ和IL-4，說(shuō)明gp90蛋白免疫雞后能夠同時(shí)刺激雞產(chǎn)生Th1和Th2型的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
　　結(jié)論：
　　gp