納米羥基磷灰石-聚羥基丁酸戊酸酯-聚乙二醇-重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2復(fù)合材料修復(fù)骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、19世紀(jì)70年代末，羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）作為新型生物材料問(wèn)世以來(lái)，引起了材料學(xué)科和醫(yī)學(xué)界的廣泛興趣。HA因其化學(xué)成分和晶體結(jié)構(gòu)與人體骨骼組織的主要無(wú)機(jī)礦物成分基本相同，引入人體后不會(huì)產(chǎn)生排異反應(yīng)，故其作為骨修復(fù)替代材料在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。其已被動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)具有無(wú)毒、無(wú)刺激性、良好的生物活性、生物相容性及骨傳導(dǎo)性、較高的機(jī)械強(qiáng)度及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[2]。但因HA的顆粒和脆性較大、缺乏可塑性、體內(nèi)降解緩

2、慢及抗疲勞破壞強(qiáng)度低，難于被機(jī)體完全替代、利用，使其臨床應(yīng)用受到了限制。 聚羥基丁酸戊酸酯（Polyhydroxybutyrate-hydroxyvalerate，PHBV）是聚羥基丁酸酯（Poly hydroxybutyrate，PHB）與羥基戊酸酯（Hydroxyvalerate，HV）的共聚物，質(zhì)輕，耐腐蝕，孔隙率、孔徑皆可控制，其具有良好的材料可塑性、機(jī)械強(qiáng)度，生物相容性、生物可降解等特點(diǎn)，且有壓電性，可刺激新骨的成長(zhǎng)。研

3、究顯示PHBV有很好的引導(dǎo)骨組織再生的功能，是一種具有很好可降解性能與生物相容性的高分子材料及較理想的引導(dǎo)骨組織再生的天然材料[7]。聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）因其分子鏈的柔順性，具有突出的理化和生物性能，具有親水性、在水和有機(jī)溶劑中的可溶性、無(wú)毒、無(wú)抗原性和免疫性[8]。在生物醫(yī)用材料應(yīng)用中，PEG或者其高分子量聚合物常被用于修飾材料，研究表明表面活性劑PEG的加入能有效地降低微粒的表面張力，改善制品的

4、團(tuán)聚性，是目前在嵌段共聚物中應(yīng)用最為廣泛的親水鏈端，在親水鏈段PEG長(zhǎng)度一定的條件下，可以通過(guò)改變疏水鏈段PLA的長(zhǎng)度來(lái)調(diào)節(jié)聚合物膠束的物理化學(xué)性質(zhì)[9，10]。以PHBV為基礎(chǔ)，選擇高親水性材料PEG與之共同混合可改善PHBV、HA在應(yīng)用中親水性差的局限性，進(jìn)而改善復(fù)合材料的生物降解性能[11]?？梢?jiàn)，將上述兩種物質(zhì)引入Nano-HA基質(zhì)材料中有望改善復(fù)合材料的可塑性、降解速度、生物相容性、機(jī)械強(qiáng)度及骨引導(dǎo)性等生物學(xué)性能。骨形態(tài)發(fā)生蛋

5、白（Bone morphogenetic protein，BMP）具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨成骨的能力[12]?；钚匀斯す侵械腂MP具有誘導(dǎo)長(zhǎng)入材料的間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞分化，分泌類(lèi)骨基質(zhì)繼而礦化成骨的能力。我們?cè)趶?fù)合材料中加入重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）活性物質(zhì)來(lái)增加復(fù)合材料的骨誘導(dǎo)性。 綜上所述，我們?cè)贜an

6、o-HA基質(zhì)材料中加入PHBV、PEG及rhBMP-2等輔助成分制成Nano-HA/PHBV-PEG-rhBMP-2復(fù)合材料人工骨，探討該復(fù)合材料能否在修復(fù)骨缺損過(guò)程中能表現(xiàn)出較單純Nano-HA更加優(yōu)良的生物學(xué)性能。 目的和意義：通過(guò)修復(fù)新西蘭大白兔橈骨骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究探討Nano-HA/PHBV-PEG-rhBMP-2復(fù)合材料人工骨對(duì)骨缺損的修復(fù)作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法：①通過(guò)人工合成方式制成Nano

7、-HA/PHBV-PEG-rhBMP-2復(fù)合材料人工骨及Nano-HA材料人工骨。②選擇50只健康雄性新西蘭大白兔，體重1.5～2.0 kg，并將其隨機(jī)分成A、B兩組：每組25只，分別將其稱(chēng)重后，用20g/L戊巴比妥納30mg/kg兔耳緣靜脈注射麻醉，常規(guī)消毒鋪巾，取兔雙側(cè)前肢中段外側(cè)切開(kāi)長(zhǎng)約3cm縱行切口，暴露橈骨干中上段，在距橈骨遠(yuǎn)端2.5cm處用線(xiàn)鋸連同骨膜一起鋸斷橈骨，以同樣的方法于第一截骨線(xiàn)近側(cè)1.5cm處再次鋸斷橈骨，連同骨

8、膜切除兩斷端間的橈骨，造成雙側(cè)橈骨節(jié)段性骨缺損模型，慶大霉素反復(fù)沖洗后，其中A組左側(cè)植入Nano-HA/PHBV-PEG-rhBMP-2復(fù)合材料人工骨，作為實(shí)驗(yàn)組；B組左側(cè)植入Nano-HA材料人工骨，作為對(duì)照組；A、B兩組右側(cè)均不植入任何材料，作為空白對(duì)照組，逐層縫合傷口。術(shù)后立即肌肉注射青霉素40萬(wàn)U/只，連續(xù)3d，不予外固定，分籠喂養(yǎng)。③觀察指標(biāo)：大體觀察：術(shù)后觀察各組動(dòng)物精神狀態(tài)、飲食、大小便、活動(dòng)情況以及傷口有無(wú)腫脹、分泌物出

9、現(xiàn)。取材后觀察各組成骨及材料降解情況。X射線(xiàn)攝片檢查：分別于材料植入術(shù)后第2周、4周、8周、12周及16周隨機(jī)選取2只兔子處死取材，行X射線(xiàn)攝片檢查，觀察各組動(dòng)物骨缺損區(qū)的骨痂生長(zhǎng)、材料降解及骨連接情況。骨密度測(cè)量：分別于材料植入術(shù)后第4周、8周、12周及16周從各組中隨機(jī)選取6只兔子處死取材，將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組標(biāo)本置雙能X線(xiàn)骨密度儀，測(cè)定骨缺損區(qū)成骨密度，對(duì)測(cè)定結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。生物力學(xué)測(cè)試：分別于材料植入術(shù)后第4周、第8周、第

10、12周、第16周在骨密度測(cè)試結(jié)束后剔凈骨膜及軟組織，在MTS-858材料測(cè)試機(jī)上行三點(diǎn)抗彎試驗(yàn)，測(cè)量各組標(biāo)本抗彎曲強(qiáng)度，對(duì)測(cè)定結(jié)果應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：大體觀察：術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)一例死亡，術(shù)后動(dòng)物進(jìn)食及活動(dòng)正常，切口無(wú)紅腫、滲液等炎性反應(yīng)，切口如期愈合。材料植入后第4～8周，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組材料逐漸降解，與骨界面模糊，有明顯新骨形成，與宿主骨組織結(jié)合緊密，以實(shí)驗(yàn)組明顯。第12～16周，兩組植入材料已基本降解完全，與宿主

11、骨逐漸融合，新生骨進(jìn)一步增多，骨缺損得到基本修復(fù)，仍以實(shí)驗(yàn)組明顯?？瞻讓?duì)照組隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)在橈骨缺損處未見(jiàn)明顯新骨形成，無(wú)明顯骨性連接形成，髓腔封閉，骨端逐漸硬化吸收，骨缺損無(wú)修復(fù)。 X射線(xiàn)檢查結(jié)果：材料植入后第2～4周：實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組材料密度較宿主骨密度高，并與宿主骨分界清楚，材料與骨結(jié)合部均有少量骨痂形成，其密度較低，以實(shí)驗(yàn)組明顯。材料植入后8周：實(shí)驗(yàn)組材料與宿主骨分界模糊，體積明顯縮小，植入材料已與受體斷端骨性愈合，

12、皮質(zhì)骨連續(xù)性較好，骨髓腔部分貫通；對(duì)照組植入材料與受體斷端骨性愈合，但皮質(zhì)骨連續(xù)性較差，骨髓腔尚未貫通。材料植入后12～16周：實(shí)驗(yàn)組植入材料逐漸與受體骨骨性愈合成一體，密度逐漸接近，骨皮質(zhì)基本連接完成，材料基本完全降解，骨髓腔已通，塑形完全，骨缺損修復(fù)完成；對(duì)照組植入材料逐漸與受體骨骨性愈合成一體，密度逐漸接近，骨皮質(zhì)連續(xù)性較差，材料大部分降解，骨缺損處充滿(mǎn)骨痂，骨髓腔基本再通，塑形基本完全，骨缺損處得到基本修復(fù)?？瞻讓?duì)照組可見(jiàn)骨缺損

13、處有一定的骨膜反應(yīng)，未見(jiàn)明顯新骨形成，無(wú)明顯骨性連接形成，骨端逐漸硬化吸收，髓腔封閉，骨缺損無(wú)修復(fù)。 骨密度測(cè)量結(jié)果：材料植入后兩組間新生骨密度整體比較有顯著性差異（F=78.748，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組（均數(shù)為0.128g/c㎡）顯著高于對(duì)照組（均數(shù)為0.093g/c㎡），分別在術(shù)后4周、8周、12周、16周時(shí)兩組間比較有顯著性差異（t4w=14.894、t8w=5.187、tt2w=3.173、t16w=4.222，P4

14、w=0.000、P8w=0.000。P12w=0.010、P16w=0.002），實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組。材料植入后不同時(shí)間點(diǎn)間新生骨密度整體比較有顯著性差異（F=115.337，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較有顯著性差異（F=126.060，P=0.000），對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較有顯著性差異（F=135.585，P=0.000），結(jié)果均為16周>12周>8周>4周。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)兩組間新生骨密度差異無(wú)顯著變化（F=

15、0.271，P=0.846）。 生物力學(xué)測(cè)定結(jié)果：材料植入后兩組間橈骨抗彎曲強(qiáng)度整體比較有顯著性差異（F=125.543，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組（均數(shù)為66.131Mpa）顯著高于對(duì)照組（均數(shù)為41.982Mpa），分別在術(shù)后4周、8周、12周、16周時(shí)兩組間比較有顯著性差異（t4w=3.245、t8w=5.530、t12w=7.303、t16w=5.806，P4w=0.009、P8w=0.000、P12w=0.000、P16

16、w=0.000），實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組。材料植入后不同時(shí)間點(diǎn)間橈骨抗彎曲強(qiáng)度整體比較有顯著性差異（F=284.006，P=0.000），實(shí)驗(yàn)組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較有顯著性差異（F=142.682，P=0.000），對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)間比較有顯著性差異（F=153.064，P=0.000），結(jié)果均為16周>12周>8周>4周。隨著材料植入術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)兩組間橈骨抗彎曲強(qiáng)度差異呈現(xiàn)逐漸顯著的趨勢(shì)（F＝7.043，P=0.001）。

17、主要結(jié)論：①較大骨缺損形成后，不植入任何替代材料或不進(jìn)行任何干預(yù)處理，骨缺損處將無(wú)明顯骨性連接形成，骨端將逐漸硬化，髓腔逐漸封閉，骨缺損難以自行修復(fù)愈合。②Nano-HA作為修復(fù)骨缺損的替代材料植入后能表現(xiàn)出較好的生物相容性、降解性及骨傳導(dǎo)性，是作為修復(fù)骨缺損的一種良好的替代植入基質(zhì)材料。③在Nano-HA材料中加入PHBV、PEG及rhBMP-2等輔助成分并人工合成的Nano-HA/PHBV-PEG-rhBMP-2復(fù)合材料人工骨，在修