子癇前期與HLA-G相關(guān)的發(fā)病機(jī)制及其子代大腦發(fā)育和功能的研究.pdf

1、子癇前期是人類妊娠期特有的多系統(tǒng)、多器官損傷的疾病。該病在孕婦中的發(fā)生率大概為3-5％，發(fā)展中國家比例更高。經(jīng)典的子癇前期是以妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓，尿蛋白等癥狀為主要特征。該疾病已經(jīng)成為主要危害了母嬰健康甚至引起死亡的妊娠期疾病。目前的研究表明，胎盤著床不足是子癇前期疾病發(fā)生的重要特征。而滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲不足是導(dǎo)致胎盤淺著床的一個(gè)重要原因。滋養(yǎng)層細(xì)胞是胚胎與母體直接接觸的部分，包括細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞三

2、個(gè)亞群。滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入母體蛻膜層不被母體排斥而快速增殖是妊娠成功的關(guān)鍵因素之一。以往的研究已經(jīng)表明表達(dá)在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的人類白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)在胚胎成功著床過程中扮演著重要的角色。滋養(yǎng)層細(xì)胞中HLA-G表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致多種妊娠期疾病包括子癇前期。HLA-G基因是非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibilitycomplex，MHC)Ⅰ類分子。現(xiàn)在已知，

3、HLA-G可以通過多種機(jī)制誘導(dǎo)母胎間免疫耐受，尤其是對母胎界面中的免疫活性細(xì)胞如NK細(xì)胞、T細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用，從而使胚胎免遭受蛻膜NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的攻擊。但是我們依然不清楚HLA-G是否可以不依賴于免疫調(diào)節(jié)作用單獨(dú)作用于滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)行為以及其調(diào)控機(jī)理。這些將有助于我們深入了解子癇前期發(fā)病機(jī)理，有助于我們對該疾病的預(yù)防和治療。所以，在本論文的第一部分，我們通過調(diào)節(jié)在JEG-3細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)來研究其功能及其機(jī)

4、制。
　　然而，目前的研究仍無法提供有效的治療和預(yù)防子癇前期疾病發(fā)生的措施。子癇前期作為人類孕期特有的疾病，不僅影響母親的身體健康也嚴(yán)重的影響了其子代的發(fā)展。流行性病學(xué)調(diào)查研究表明子癇前期患者的子代在其成年后易發(fā)生發(fā)育性呼吸窘迫綜合癥，高血壓，中風(fēng)等疾病。所以有必要建立子癇前期疾病的動(dòng)物模型以有利于進(jìn)一步理解子癇前期的發(fā)病機(jī)理和其對子代的影響。之前的研究表明對動(dòng)物進(jìn)行N∞硝基L精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-Arginine M

5、ethyEster, L-NAME)處理（一種一氧化氮合成抑制劑）可以導(dǎo)致子癇前期樣特征的產(chǎn)生。之前的研究主要集中在子癇前期子代的肺、腎臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育和功能的研究。而子癇前期發(fā)病的時(shí)間恰是胚胎大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期。在本論文的第二部分中，我們使用了妊娠14.5天的Sprague-Dawley大鼠來闡明子癇前期樣大鼠模型中子代鼠大腦發(fā)育及功能變化及其可能的機(jī)制。
　　第一部分 HLA-G調(diào)控JEG-3侵襲力的細(xì)胞信號通路的研究

6、r>　　目的:通過上調(diào)和下調(diào)HLA-G在JEG-3細(xì)胞中的表達(dá)，研究其不依賴于與免疫細(xì)胞相互作用，在調(diào)節(jié)JEG-3細(xì)胞生物學(xué)行為中的功能及其分子機(jī)制。
　　方法:用轉(zhuǎn)染HLA-G特異性siRNA來下調(diào)HLA-G的表達(dá)。用外加humangalectin-1的方法上調(diào)HLA-G的表達(dá)。用transwell的方法觀察上調(diào)和下調(diào)HLA-G表達(dá)后，JEG-3細(xì)胞的侵襲力。用Brdu急性摻入法及PH3標(biāo)記法觀察下調(diào)HLA-G表達(dá)后JEG-3細(xì)

7、胞的增殖情況，activated cleaveage caspase3標(biāo)記法觀察下調(diào)HLA-G表達(dá)后JEG-3細(xì)胞的凋亡情況。用Western blot的方法研究HLA-G被上調(diào)和下調(diào)后STAT3磷酸化程度的變化。外加白介素6(interleukin-6，IL-6)來研究其能否恢復(fù)HLA-G被下調(diào)后STAT3磷酸化程度和JEG-3細(xì)胞的侵襲力。
　　結(jié)果:1）在HLA-G表達(dá)下調(diào)后，JEG-3細(xì)胞的增殖凋亡沒有發(fā)生明顯變化但是其侵

8、襲能力明顯下降。2）下調(diào)HLA-G表達(dá)后，信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)的磷酸化程度明顯下降。3）使用人類凝集素1(human galectin-1)處理JEG-3細(xì)胞可以上調(diào)HLA-G表達(dá)，促進(jìn)STAT3的活化，并且增加JEG-3細(xì)胞侵襲能力。4）發(fā)現(xiàn)IL-6，但不是humangalectin-1可以通過提高STAT3磷酸化程度來

9、恢復(fù)HLA-G下調(diào)后引起的侵襲力下降。
　　結(jié)論:這一結(jié)果揭示了STAT3磷酸化程度是HLA-G直接調(diào)節(jié)JEG-3細(xì)胞的侵襲力的關(guān)鍵生物學(xué)事件。這是HLA-G低表達(dá)導(dǎo)致子癇前期發(fā)生的原因。
　　第二部分 子癇前期樣大鼠子代大腦發(fā)育和功能的研究
　　目的:構(gòu)建子癇前期樣大鼠模型，并研究子癇前期樣的大鼠子代大腦發(fā)育和功能是否受到影響及其細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　方法:把妊娠的母鼠隨機(jī)分成兩組。實(shí)驗(yàn)組從妊娠14.5天到21

10、天喂食含50mg·kg-1·d-1L-NAME的水，對照組喂食清水。用血壓和尿蛋白測定來確定模型的建立。用免疫組化方法來研究P0仔鼠大腦發(fā)育狀況。用水迷宮實(shí)驗(yàn)來研究8周齡雄性子代鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。用免疫組化的方法來研究8周齡雄性子代鼠大腦的結(jié)構(gòu)及發(fā)育情況。用realtime PCR的方法檢測神經(jīng)元生成相關(guān)基因的表達(dá)情況。并用BSP方法檢測相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)。用Western blot的方法檢測了學(xué)習(xí)記憶LTP相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況。<

11、br>　　結(jié)果:1）成功構(gòu)建子癇前期樣大鼠模型。2）發(fā)現(xiàn)子癇前期樣大鼠子代P0仔鼠體重和腦重比正常的大鼠子代的小，但腦-體重比沒有明顯的變化。3）P0仔鼠皮層的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、分化、凋亡情況沒有明顯的變化，但神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生層的增殖能力明顯的下降，增殖相關(guān)的基因(Fgf2，Creb和Ep300)也有明顯下調(diào)。4）發(fā)現(xiàn)8周齡子癇前期樣大鼠子代的大腦皮層板層結(jié)構(gòu)和皮層厚度沒有明顯變化，并且腦重和體重都明顯的回復(fù)到正常組大鼠子代的水平。5）發(fā)

12、現(xiàn)8周齡的子癇前期樣大鼠子代的空間學(xué)習(xí)和記憶能力低于正常組。6）分析學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的細(xì)胞和分子機(jī)理，初步發(fā)現(xiàn)在子癇前期樣大鼠子代的膠質(zhì)細(xì)胞有顯著增生，并且成年海馬新生神經(jīng)元的生成能力變?nèi)酰鲋诚嚓P(guān)的基因表達(dá)（Fgf2）有顯著性變化。7）發(fā)現(xiàn)Fgf2，Creb和Ep300基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度無變化。8）發(fā)現(xiàn)LTP相關(guān)蛋白ERK，JNK在表達(dá)和磷酸化水平都無變化。
　　結(jié)論:我們的結(jié)果表明子癇前期樣大鼠子代的大腦發(fā)育和功能受到明顯的影