天然牛角材料的生物相容性的初步研究.pdf

1、目的:生物材料在臨床中的重要性日益突出，已大量應(yīng)用于骨科、心血管內(nèi)科、傷口護(hù)理及整形外科等多個(gè)領(lǐng)域。天然牛角材料屬于生物衍生材料，其主要成分為含有17種氨基酸及無(wú)機(jī)元素的緊密排列的角蛋白，具有成本低、易于制備、理化性質(zhì)良好等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)天然牛角材料的生物相容性進(jìn)行初步研究，從而為其臨床應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:天然牛角材料浸提液制備
　　取天然牛角，制備成10mm×5mm×5mm的長(zhǎng)方體，經(jīng)脫脂、超聲清洗、高壓蒸

2、汽滅菌后置入Eppendof管中加入2.0mL浸提介質(zhì)（細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)浸提介質(zhì)為RPMI1640培養(yǎng)液，溶血實(shí)驗(yàn)、急性毒實(shí)驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)浸提介質(zhì)為生理鹽水），在培養(yǎng)箱中保存3天后收集浸提液并保存。
　　細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn):將L929細(xì)胞分別用RPMI1640培養(yǎng)液、50％天然牛角材料浸提液及100％天然牛角材料浸提液吹打成單細(xì)胞懸液培養(yǎng)、傳代，然后分別于24小時(shí)、48小時(shí)及72h在顯微鏡下觀察L929細(xì)

3、胞的形態(tài)變化。
　　MTT實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組（RPMI1640培養(yǎng)液）、50％天然牛角材料浸提液組及100％天然牛角材料浸提液組。將L-929細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后棄去原液，分別加入上述3組溶液再次置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24小時(shí)、48h小時(shí)及72小時(shí)后取出一塊96孔板，加MTT液，加DMSO，在免疫酶標(biāo)儀上測(cè)定492nm處的吸光度(0D)值。
　　溶血實(shí)驗(yàn)
　　抽取兔

4、血10ml，加入抗凝劑，制備成符合實(shí)驗(yàn)要求的稀釋兔血。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（生理鹽水）、陽(yáng)性對(duì)照組（蒸餾水）及實(shí)驗(yàn)組（天然牛角材料浸提液）。分別取各組溶液10ml，預(yù)溫30分鐘（37℃水浴箱），各加入稀釋兔血0.2ml，保溫60分鐘（37℃水浴箱），離心5分鐘，最后在免疫酶標(biāo)儀上測(cè)定540nm處的吸光度(OD)值。
　　急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　將20只小鼠隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注射天然牛角材料浸提液（劑量為50ml/Kg），

5、對(duì)照組小鼠腹腔內(nèi)注射與實(shí)驗(yàn)組小鼠同等劑量的生理鹽水。注射后立刻觀察兩組小鼠狀態(tài)，并稱(chēng)量其體重，并分別于24小時(shí)、48小時(shí)及72h后重復(fù)觀察、稱(chēng)重。
　　遲發(fā)型實(shí)驗(yàn)方法
　　實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組（天然牛角材料浸提液）、陰性對(duì)照組（生理鹽水）及陽(yáng)性對(duì)照組（5％甲醛）。誘導(dǎo)階段:分別將20mm×20mm敷料浸透天然牛角材料浸提液、生理鹽水及5％甲醛后局部貼覆在兩組動(dòng)物體上，固定6小時(shí)，間隔1周重復(fù)該步驟，連續(xù)操作3周。激發(fā)階段:最后一次

6、貼覆14天后，再用20mm×20mm敷料浸透相應(yīng)溶液局部貼覆于動(dòng)物去毛未試部位，6小時(shí)后去除。動(dòng)物觀察:激發(fā)接觸24小時(shí)后觀察相應(yīng)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后，50％、100％天然牛角材料浸提液組與陰性對(duì)照組相比，對(duì)L929細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響相似。細(xì)胞形態(tài)呈梭形、三角形或不規(guī)則形，貼壁生長(zhǎng)良好，胞漿內(nèi)偶見(jiàn)離散顆粒，無(wú)細(xì)胞溶解，細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
　　2通過(guò)多變量

7、方差分析法對(duì)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得到Wilks'Lambda值為0.736，F(xiàn)值為1.711，P值為0.133＞0.05，表明實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD均值在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在各個(gè)時(shí)間段、各個(gè)實(shí)驗(yàn)組計(jì)算所得RGR％均＞100％，毒性均屬0級(jí)。
　　3陰性對(duì)照組0D均值為0.005，陽(yáng)性對(duì)照組0D均值為0.705，天然牛角材料浸提液0D均值為0.016;天然牛角材料浸提液溶血率(％)=(0.016-0.005)/(0.

8、753-0.005)×100％=0.124％。
　　4實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物一般狀況良好，觀察期內(nèi)兩組小鼠均無(wú)運(yùn)動(dòng)減少、呼吸困難、腹部刺激癥狀、衰竭、發(fā)紺和動(dòng)物死亡等毒性反應(yīng)。
　　兩組小鼠體重均呈上升趨勢(shì)且通過(guò)重復(fù)測(cè)量方差分析法分析結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在24小時(shí)、48小時(shí)及72h不同觀察時(shí)間內(nèi)小鼠體重均數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間小鼠體重均數(shù)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5用K

9、-W-H秩和檢驗(yàn)法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:①紅斑做評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)生紅斑的嚴(yán)重程度及發(fā)生率均明顯大于實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組（P＜0.000）;雖然實(shí)驗(yàn)組紅斑發(fā)生率(30％)大于陰性對(duì)照組(0％)，但是其發(fā)生紅斑的嚴(yán)重程度較輕且與陰性對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.070)。②水腫做評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性對(duì)照組發(fā)生水腫的嚴(yán)重程度及發(fā)生率均明顯大于實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組（P＜0.000）;雖然實(shí)驗(yàn)組水腫發(fā)生率(30％)大于陰性對(duì)照組(0％)，但是其發(fā)生