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文檔簡介
1、目的:生物材料在臨床中的重要性日益突出,已大量應(yīng)用于骨科、心血管內(nèi)科、傷口護(hù)理及整形外科等多個領(lǐng)域。天然牛角材料屬于生物衍生材料,其主要成分為含有17種氨基酸及無機(jī)元素的緊密排列的角蛋白,具有成本低、易于制備、理化性質(zhì)良好等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬通過對天然牛角材料的生物相容性進(jìn)行初步研究,從而為其臨床應(yīng)用打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
方法:天然牛角材料浸提液制備
取天然牛角,制備成10mm×5mm×5mm的長方體,經(jīng)脫脂、超聲清洗、高壓蒸
2、汽滅菌后置入Eppendof管中加入2.0mL浸提介質(zhì)(細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)浸提介質(zhì)為RPMI1640培養(yǎng)液,溶血實(shí)驗(yàn)、急性毒實(shí)驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)浸提介質(zhì)為生理鹽水),在培養(yǎng)箱中保存3天后收集浸提液并保存。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn):將L929細(xì)胞分別用RPMI1640培養(yǎng)液、50%天然牛角材料浸提液及100%天然牛角材料浸提液吹打成單細(xì)胞懸液培養(yǎng)、傳代,然后分別于24小時、48小時及72h在顯微鏡下觀察L929細(xì)
3、胞的形態(tài)變化。
MTT實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(RPMI1640培養(yǎng)液)、50%天然牛角材料浸提液組及100%天然牛角材料浸提液組。將L-929細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液接種于96孔板中,置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后棄去原液,分別加入上述3組溶液再次置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24小時、48h小時及72小時后取出一塊96孔板,加MTT液,加DMSO,在免疫酶標(biāo)儀上測定492nm處的吸光度(0D)值。
溶血實(shí)驗(yàn)
抽取兔
4、血10ml,加入抗凝劑,制備成符合實(shí)驗(yàn)要求的稀釋兔血。實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組(生理鹽水)、陽性對照組(蒸餾水)及實(shí)驗(yàn)組(天然牛角材料浸提液)。分別取各組溶液10ml,預(yù)溫30分鐘(37℃水浴箱),各加入稀釋兔血0.2ml,保溫60分鐘(37℃水浴箱),離心5分鐘,最后在免疫酶標(biāo)儀上測定540nm處的吸光度(OD)值。
急性毒性實(shí)驗(yàn)
將20只小鼠隨機(jī)分為兩組,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔內(nèi)注射天然牛角材料浸提液(劑量為50ml/Kg),
5、對照組小鼠腹腔內(nèi)注射與實(shí)驗(yàn)組小鼠同等劑量的生理鹽水。注射后立刻觀察兩組小鼠狀態(tài),并稱量其體重,并分別于24小時、48小時及72h后重復(fù)觀察、稱重。
遲發(fā)型實(shí)驗(yàn)方法
實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組(天然牛角材料浸提液)、陰性對照組(生理鹽水)及陽性對照組(5%甲醛)。誘導(dǎo)階段:分別將20mm×20mm敷料浸透天然牛角材料浸提液、生理鹽水及5%甲醛后局部貼覆在兩組動物體上,固定6小時,間隔1周重復(fù)該步驟,連續(xù)操作3周。激發(fā)階段:最后一次
6、貼覆14天后,再用20mm×20mm敷料浸透相應(yīng)溶液局部貼覆于動物去毛未試部位,6小時后去除。動物觀察:激發(fā)接觸24小時后觀察相應(yīng)指標(biāo)。
結(jié)果:
1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)24小時、48小時及72小時后,50%、100%天然牛角材料浸提液組與陰性對照組相比,對L929細(xì)胞形態(tài)及增殖的影響相似。細(xì)胞形態(tài)呈梭形、三角形或不規(guī)則形,貼壁生長良好,胞漿內(nèi)偶見離散顆粒,無細(xì)胞溶解,細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
2通過多變量
7、方差分析法對MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,得到Wilks'Lambda值為0.736,F(xiàn)值為1.711,P值為0.133>0.05,表明實(shí)驗(yàn)組與對照組OD均值在各個時間段內(nèi)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在各個時間段、各個實(shí)驗(yàn)組計(jì)算所得RGR%均>100%,毒性均屬0級。
3陰性對照組0D均值為0.005,陽性對照組0D均值為0.705,天然牛角材料浸提液0D均值為0.016;天然牛角材料浸提液溶血率(%)=(0.016-0.005)/(0.
8、753-0.005)×100%=0.124%。
4實(shí)驗(yàn)組及對照組動物一般狀況良好,觀察期內(nèi)兩組小鼠均無運(yùn)動減少、呼吸困難、腹部刺激癥狀、衰竭、發(fā)紺和動物死亡等毒性反應(yīng)。
兩組小鼠體重均呈上升趨勢且通過重復(fù)測量方差分析法分析結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與對照組在24小時、48小時及72h不同觀察時間內(nèi)小鼠體重均數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)組與對照組在24小時、48小時及72小時三個時間點(diǎn)之間小鼠體重均數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
5用K
9、-W-H秩和檢驗(yàn)法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:①紅斑做評價標(biāo)準(zhǔn),陽性對照組發(fā)生紅斑的嚴(yán)重程度及發(fā)生率均明顯大于實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組(P<0.000);雖然實(shí)驗(yàn)組紅斑發(fā)生率(30%)大于陰性對照組(0%),但是其發(fā)生紅斑的嚴(yán)重程度較輕且與陰性對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.070)。②水腫做評價標(biāo)準(zhǔn),陽性對照組發(fā)生水腫的嚴(yán)重程度及發(fā)生率均明顯大于實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組(P<0.000);雖然實(shí)驗(yàn)組水腫發(fā)生率(30%)大于陰性對照組(0%),但是其發(fā)生
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