磷酸鹽梯度膠原材料的制備及其生物相容性的初步研究.pdf

1、前交叉韌帶-骨（ACL-to-Bone）界面組織包括四種不同的組織區(qū)域：韌帶，非礦化的界面組織，礦化的界面組織，和骨。不同的組織區(qū)域含有不同的材料成分和細(xì)胞。在韌帶區(qū)域，成纖維細(xì)胞處于由膠原Ⅰ和膠原Ⅲ組成的基質(zhì)中，而非礦化的界面組織區(qū)域，卵圓型的軟骨細(xì)胞處于由膠原Ⅱ和蛋白聚糖組成的區(qū)域。礦化的界面組織含有肥大的軟骨細(xì)胞。軟骨下骨是由成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞及膠原Ⅰ基質(zhì)組成。
　　界面組織工程需要梯度的支架材料和可分化為不同類型細(xì)

2、胞的種子細(xì)胞。梯度生物材料在化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、力學(xué)和生物分子等各種特征中具有各向異性。梯度生物材料已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域特別是組織工程中必不可少的研究熱點(diǎn)。目前，各種各樣天然或合成的生物材料已被用于制備組織支架材料，并且被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域。水凝膠具有設(shè)計(jì)靈活、水合性、粘性等特性，能很好的模仿體內(nèi)ECM性質(zhì)，是界面組織工程理想的材料。在界面組織修復(fù)和再生過(guò)程中，細(xì)胞在不同區(qū)域行使不同的功能，因此細(xì)胞的選擇非常重要。來(lái)自肌腱組織的成體干細(xì)胞-肌

3、腱干細(xì)胞除具有干細(xì)胞的通性，還具有增殖速度快、能高效向軟組織細(xì)胞分化的能力，是界面組織工程種子細(xì)胞的理想選擇。
　　本課題主要包括制備磷酸鹽梯度的膠原材料、肌腱干細(xì)胞的分離和鑒定、磷酸鹽梯度的膠原材料的生物相容性。
　　主要方法與結(jié)果如下：
　　①鼠尾膠原Ⅰ的提取、純化和鑒定：依醋酸提取法制備鼠尾膠原初提物，鹽析、半透膜純化、冷凍干燥得到銀白色蓬松狀鼠尾膠原。采用SDS-PAGE凝膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色法、紅外光譜分析（

4、FITR）鑒定確定所得為高純度鼠尾膠原Ⅰ。
　?、诹姿猁}鼠尾膠原梯度材料的制備：采用梯度溶液礦化法制備磷酸鹽梯度膠原材料。掃描電鏡分析可知，磷酸鈣混合物與鼠尾膠原Ⅰ結(jié)合，有明顯界面差異，上層磷酸鈣混合物沉淀顆粒較少，而下層較多。
　?、哿姿猁}鼠尾膠原梯度材料與大鼠生物相容性分析：以SD大鼠為移植載體，HE染色分析材料降解屬性，DAPI染色考察材料細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果可知：梯度材料移植兩周后沒(méi)有完全降解，大量細(xì)胞浸入材料內(nèi)部。

5、>　?、芗‰旄杉?xì)胞（TSPCs）的分離、培養(yǎng)、鑒定：取SD大鼠跟腱組織，Ⅰ型膠原酶消化、選取克隆團(tuán)，經(jīng)三向分化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，確定該細(xì)胞為肌腱干細(xì)胞。
　?、萘姿猁}鼠尾膠原梯度材料肌腱干細(xì)胞相容性分析：將肌腱干細(xì)胞種植于磷酸鹽鼠尾膠原梯度材料中，兩周內(nèi)取時(shí)間點(diǎn)DAPI染色觀察，肌腱干細(xì)胞在材料內(nèi)生長(zhǎng)良好。
　　綜上所述，制備的磷酸鹽鼠尾膠原梯度材料具有特異的微細(xì)結(jié)構(gòu)、良好的生物相容性。分離得到的肌腱干細(xì)胞（