重組蛛絲蛋白支架材料生物相容性的研究.pdf

1、重組蛛絲蛋白作為一種新型的生物材料在組織工程領域得到廣泛關注。利用本室先期已構(gòu)建含有細胞黏附位點RGD的基因工程菌pNSR-32/BL21(DE3)pLysS進行高密度發(fā)酵，建立適合pNSR-32基因工程菌表達蛋白的純化方法。確定的最終純化方案為：按1:5(m/v)的比例混懸濕菌體和磷酸鹽緩沖液，70％功率冰浴超聲10min，脈沖9s，脈停2s。80℃加熱超聲液10min，調(diào)節(jié)pH至5.5。離心，上清用15％飽和度硫酸銨溶液沉淀1.5h

2、，調(diào)上清液pH至蛋白等電點6.5。離心后收集沉淀，透析凍干保存。按上述方法進行純化，目的蛋白純度達到85％以上，得率約在1.5～2.5mg/g濕菌體。 將純化的重組蛛絲蛋白作為原料，按本室所建立的方法制備支架材料，評價其細胞相容性。采用MTT的方法討論重組蛛絲蛋白支架材料的細胞毒性，并通過NIH-3T3細胞與支架材料復合培養(yǎng)研究支架材料對細胞黏附、生長和分化的影響。MTT實驗結(jié)果表明，重組蛛絲蛋白支架材料浸提液對NIH-3T3細

3、胞的生長和增殖影響較小，根據(jù)細胞毒性實驗毒性評定標準，判定重組蛛絲蛋白支架材料毒性等級在1級以下，符合合格生物材料的要求。電子掃描電鏡(SEM)和常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，含有RGD三肽的重組蛛絲蛋白支架材料更利于NIH-3T3細胞黏附，細胞在材料表面形成多層結(jié)構(gòu)且深入材料內(nèi)部生長。堿性成纖維生長因子(bFGF)免疫組化實驗結(jié)果說明復合培養(yǎng)的NIH-3T3細胞可以表達bFGF因子。 通過建立大鼠背部深度燙傷模型，研究重組蛛絲蛋白支架

4、材料一細胞復合物對深度燙傷創(chuàng)面愈合的影響。用pNSR-16和pNSR-32兩種材料與NIH-3T3細胞復合物修復燙傷創(chuàng)面，兩者的羥脯氨酸含量均高于其余各組。HE染色結(jié)果顯示，在創(chuàng)面愈合初期，pNSR-16和pNSR-32兩種材料與細胞復合物的創(chuàng)面修復情況比其余各組活躍。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF因子在細胞增殖活躍的創(chuàng)面修復部位均有較高表達，pNSR-16和pNSR-32兩種材料與細胞復合物組比其余組表達bFGF明顯。以上結(jié)果初步表明，重