重組蛛絲蛋白支架材料生物相容性的研究.pdf

1、重組蛛絲蛋白作為一種新型的生物材料在組織工程領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。利用本室先期已構(gòu)建含有細(xì)胞黏附位點(diǎn)RGD的基因工程菌pNSR-32/BL21(DE3)pLysS進(jìn)行高密度發(fā)酵，建立適合pNSR-32基因工程菌表達(dá)蛋白的純化方法。確定的最終純化方案為：按1:5(m/v)的比例混懸濕菌體和磷酸鹽緩沖液，70％功率冰浴超聲10min，脈沖9s，脈停2s。80℃加熱超聲液10min，調(diào)節(jié)pH至5.5。離心，上清用15％飽和度硫酸銨溶液沉淀1.5h

2、，調(diào)上清液pH至蛋白等電點(diǎn)6.5。離心后收集沉淀，透析凍干保存。按上述方法進(jìn)行純化，目的蛋白純度達(dá)到85％以上，得率約在1.5～2.5mg/g濕菌體。 將純化的重組蛛絲蛋白作為原料，按本室所建立的方法制備支架材料，評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性。采用MTT的方法討論重組蛛絲蛋白支架材料的細(xì)胞毒性，并通過NIH-3T3細(xì)胞與支架材料復(fù)合培養(yǎng)研究支架材料對(duì)細(xì)胞黏附、生長和分化的影響。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組蛛絲蛋白支架材料浸提液對(duì)NIH-3T3細(xì)

3、胞的生長和增殖影響較小，根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)毒性評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，判定重組蛛絲蛋白支架材料毒性等級(jí)在1級(jí)以下，符合合格生物材料的要求。電子掃描電鏡(SEM)和常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，含有RGD三肽的重組蛛絲蛋白支架材料更利于NIH-3T3細(xì)胞黏附，細(xì)胞在材料表面形成多層結(jié)構(gòu)且深入材料內(nèi)部生長。堿性成纖維生長因子(bFGF)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明復(fù)合培養(yǎng)的NIH-3T3細(xì)胞可以表達(dá)bFGF因子。 通過建立大鼠背部深度燙傷模型，研究重組蛛絲蛋白支架

4、材料一細(xì)胞復(fù)合物對(duì)深度燙傷創(chuàng)面愈合的影響。用pNSR-16和pNSR-32兩種材料與NIH-3T3細(xì)胞復(fù)合物修復(fù)燙傷創(chuàng)面，兩者的羥脯氨酸含量均高于其余各組。HE染色結(jié)果顯示，在創(chuàng)面愈合初期，pNSR-16和pNSR-32兩種材料與細(xì)胞復(fù)合物的創(chuàng)面修復(fù)情況比其余各組活躍。免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，bFGF因子在細(xì)胞增殖活躍的創(chuàng)面修復(fù)部位均有較高表達(dá)，pNSR-16和pNSR-32兩種材料與細(xì)胞復(fù)合物組比其余組表達(dá)bFGF明顯。以上結(jié)果初步表明，重