解淀粉芽孢桿菌NJN--6拮抗物質(zhì)的分離鑒定及對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響研究.pdf

1、土傳枯萎病是由土傳病原菌引起的毀滅性作物病害，嚴(yán)重制約著經(jīng)濟(jì)作物的生產(chǎn)。近年來，生物措施在土傳病害的防控方面發(fā)揮著越來越重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室從香蕉園發(fā)病區(qū)的健康植株根際分離得到了一株解淀粉芽孢桿菌NJN-6(以下均簡(jiǎn)寫為NJN-6)，該菌株在實(shí)驗(yàn)室條件下能強(qiáng)烈抑制香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌和番茄青枯病茄科勞爾氏菌的生長(zhǎng)，并且在盆栽和大田試驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著的促生和生防效果，但是其作用機(jī)理尚不清楚。本研究以NJN-6為供試菌株，分離鑒定其拮

2、抗尖孢鐮刀菌和茄科勞爾氏菌的活性物質(zhì)，研究該菌株在香蕉的根際定殖能力以及利用香蕉根系分泌物生產(chǎn)拮抗物質(zhì)的能力，然后采用高通量測(cè)序和定量PCR技術(shù)研究外源添加拮抗物質(zhì)對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響。得到了如下主要結(jié)果:
　　1.利用正丁醇從NJN-6的發(fā)酵液中萃取得到iturinA類拮抗物質(zhì)，通過高效液相色譜(HPLC)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間定性鑒定出三種iturinA物質(zhì)的存在。然后，利用HPLC/ESI-MS證明這三種物質(zhì)的分子量分別為

3、1043、1057和1071 Da，與三種iturin A標(biāo)準(zhǔn)品的分子量一致。利用大孔吸附樹脂XAD-16，從NJN-6的發(fā)酵液中富集有效活性物質(zhì)，通過HPLC結(jié)合自動(dòng)餾分收集器分離得到五種活性物質(zhì)。其中兩種物質(zhì)具有拮抗香蕉病原菌的作用，且被證明是分子量分別為1030Da(C14)和1044 Da(C15)的bacillomycin D。另外三種物質(zhì)能夠拮抗番茄青枯病病原菌，且被證明分子量是分別為402、487和502 Da的macro

4、lactin A、7-O-malonyl macrolactin A和7-O-succinylmacrolactin A。分離鑒定出的八種拮抗物質(zhì)中，五種能夠抑制真菌的生長(zhǎng)，三種能抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。
　　2.構(gòu)建了一種環(huán)保、快速、便捷的雙水相體系:乙醇-硫酸銨系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)從NJN-6菌株的發(fā)酵液中萃取得到iturinA，隨后用HPLC對(duì)iturin A進(jìn)行了定量分析。通過優(yōu)化萃取體系的pH得到了95％以上的萃取回收率，通過優(yōu)化H

5、PLC分析的柱溫得到了較好的分離效果。該檢測(cè)方法中iturin A出峰時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.29％和1.45％。整個(gè)萃取和檢測(cè)過程用時(shí)短、操作便捷，是一種快速定量發(fā)酵液中活性物質(zhì)的定量方法。
　　3.菌株NJN-6不僅能夠分泌水溶性的拮抗物質(zhì)，以便抑制病原菌的生長(zhǎng)，而且還能在較遠(yuǎn)距離對(duì)尖孢鐮刀菌產(chǎn)生抑制作用（超出水溶性物質(zhì)的有效擴(kuò)散范圍），甚至在有物理阻隔完全切斷水溶性物質(zhì)交流的情況下（分隔平板中）仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制

6、作用，表明NJN-6能夠分泌揮發(fā)性的抑菌物質(zhì)。在分隔平板實(shí)驗(yàn)中，NJN-6產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)能夠抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)，其抑制效率達(dá)到了35％。甚至能夠顯著地降低土壤中尖孢鐮刀菌的孢子濃度，處理35天后，與對(duì)照相比，土壤中尖孢鐮刀菌孢子的濃度降低了1個(gè)數(shù)量級(jí)。利用固相微萃取對(duì)NJN-6產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行有效富集，然后利用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。鑒定出的36種小分子的揮發(fā)性物質(zhì)包含12種芳香類、7

7、種烷烴類、3種醇類、7種酮類、2種烯烴類、3種萘酚類、1種酯類和1種醚類。通過純品驗(yàn)證結(jié)果顯示，有11種物質(zhì)能夠完全抑制尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng);另外7種物質(zhì)顯示出了較好的抑制效果（抑制率＞80％）;其余18種物質(zhì)的抑制效果在6.12％和78.8％之間。鑒定出的這些物質(zhì)及其良好的對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制效果表明了揮發(fā)性物質(zhì)的分泌在NJN-6菌株拮抗尖孢鐮刀菌過程中起重要作用。
　　4.通過純培養(yǎng)條件下，利用掃描電鏡對(duì)NJN-6的生物膜形成和

8、根際定殖能力進(jìn)行測(cè)試，表明NJN-6具有在香蕉根際良好的定殖能力。采用根系分泌物作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)NJN-6振蕩培養(yǎng)后，對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NJN-6能利用根系分泌物產(chǎn)生脂肽類拮抗物質(zhì)和植物類激素促生物質(zhì);同時(shí)，該菌株在根系分泌物存在的條件下，其產(chǎn)拮抗物質(zhì)基因和生物膜形成基因均上調(diào)表達(dá)。綜合兩方面的結(jié)果表明，NJN-6菌株能夠在根際定殖，并且利用根系分泌物生存繁殖并且產(chǎn)生活性物質(zhì)。
　　5.Macrolactin是一類抗

9、菌效果極佳的細(xì)菌生長(zhǎng)抑制劑。然而，其對(duì)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及土壤中本身產(chǎn)macrolactin基因豐度的影響尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過外源添加從NJN-6發(fā)酵液中分離出的macrolactin類物質(zhì)到土壤后，研究其對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響。經(jīng)過四周的處理，表明macrolactin類物質(zhì)能顯著地降低細(xì)菌群落的生態(tài)多樣性和大多數(shù)類群的相對(duì)豐度。但變形菌門，尤其是伯克氏菌屬、Dyella屬和Rhodanobacter屬的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度不但沒有減少

10、，反正有不同程度的增加。文獻(xiàn)報(bào)道，這三個(gè)屬的菌均有降解農(nóng)業(yè)化學(xué)品的作用。同時(shí)，macrolactin類物質(zhì)的添加致使土壤本身產(chǎn)macrolactin類物質(zhì)的polyketide synthase(PKS)基因豐度顯著下降。
　　6.脂肽作為一大類抗真菌物質(zhì)，具有顯著抑制真菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的作用。同樣，其對(duì)土壤真菌群落以及土壤中產(chǎn)脂肽基因豐度的影響并無相關(guān)報(bào)道。本文通過外源添加從NJN-6發(fā)酵液中分離獲得的脂肽類物質(zhì)到土壤后，研

11、究其對(duì)土壤真菌群落的影響。結(jié)果表明微生物源的抗真菌物質(zhì)-脂肽類物質(zhì)的施入能顯著地降低真菌的豐度和真菌群落的多樣性，而木質(zhì)素降解相關(guān)真菌類群（毛孢子菌屬和隱球菌屬）的相對(duì)豐度在外源添加脂肽物質(zhì)后顯著增加。同時(shí)，土壤自身中產(chǎn)拮抗物質(zhì)的Non-ribosomal peptides synthase(NRPS)基因豐度隨著脂肽類物質(zhì)的加入而顯著降低。證明微生物源的抗真菌物質(zhì)和化學(xué)合成的農(nóng)業(yè)殺真菌劑一樣能夠改變土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，廣譜性的殺滅有益

12、菌和病原菌。而土壤本土拮抗物質(zhì)的基因豐度也因?yàn)橥庠崔卓刮镔|(zhì)的加入而發(fā)生顯著的變化。這些結(jié)果將對(duì)后續(xù)微生物源拮抗物質(zhì)的大田使用提供相關(guān)參考。
　　7.采用分隔平板（一邊培養(yǎng)菌株，一邊放置土壤）培養(yǎng)NJN-6實(shí)時(shí)產(chǎn)生得到揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)，以此衡量其對(duì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成以及部分功能基因產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)土壤總細(xì)菌豐度具有增加作用，而對(duì)土壤總真菌豐度具有降低作用。高通量測(cè)序表明揮發(fā)性有機(jī)物顯著地降低了土壤細(xì)菌和真菌群

13、落結(jié)構(gòu)的alpha多樣性。另外，揮發(fā)性物質(zhì)還對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的兩種主要拮抗物質(zhì)的相關(guān)基因-PKS和NRPS產(chǎn)生顯著地抑制作用，同時(shí)降低了參與氮循環(huán)過程中的AOA、nifH和nirS的基因豐度，增加了AOB的基因豐度。
　　結(jié)論:解淀粉芽孢桿菌NJN-6能夠產(chǎn)生大量拮抗土傳枯萎病原菌和拮抗番茄青枯病病原菌的物質(zhì)，是一株防控土傳病害的良好生防菌;能夠利用根系分泌物在根際定殖和分泌活性物質(zhì)，而這些具有抗菌作用的微生物源拮抗物質(zhì)會(huì)顯著影響