畜禽肉和活蝦中弧菌鑒定及第三代頭孢耐藥機制初探.pdf

1、畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展在為人類提供足夠的畜禽和水產(chǎn)品的同時，也通過食物鏈提高了動物源耐藥致病菌引起的人類健康風險，目前致病性弧菌對人類的威脅越來越嚴重。本文就圍繞畜禽和水產(chǎn)品中致病性弧菌分離鑒定，及這些弧菌的耐藥性進行研究，實驗分為3個部分:
　　一、畜禽肉和活蝦中弧菌的分離鑒定及毒力基因檢測
　　本試驗旨在分離鑒定深圳市畜禽和水產(chǎn)品（牛、豬、雞、蝦）中的主要弧菌，并檢測其毒力因子、毒力相關(guān)基因分布特征，為控制畜牧生產(chǎn)中致

2、病弧菌的產(chǎn)生和傳播提供理論依據(jù)。試驗于不同時間、相同地點采集深圳某區(qū)畜禽肉和活蝦樣品進行弧菌的分離，采用多重PCR和測序方法鑒定疑似孤菌，在此基礎(chǔ)上檢測副溶血性弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的毒力基因。結(jié)果表明，蝦肉樣品中弧菌的檢出率為65.22％，畜禽肉樣品中弧菌的檢出率為12.38％,總體檢出率為25.45％;共鑒定獲得100株副溶血性弧菌、23株溶藻弧菌和1株創(chuàng)傷弧菌。100株副溶血性弧菌中只檢測到2株存在trh基因，均未檢測到tdh基

3、因;23株溶藻弧菌中，檢測到了FlaA、ompW、 fur、collagenase、toxS、UreR基因，未檢測到tdh、trh、toxR基因;而1株創(chuàng)傷弧菌中未發(fā)現(xiàn)任何毒力因子。以上結(jié)果表明，深圳某區(qū)畜禽肉和活蝦中存在一定數(shù)量的致病性弧菌，溶藻弧菌中致病因子既復(fù)雜又獨特，需加強畜禽及蝦等水產(chǎn)動物養(yǎng)殖過程中的衛(wèi)生防疫，以控制其肉制品中致病弧菌的攜帶和對人類健康的安全隱患。
　　二、弧菌的耐藥性分析及ESBLs檢測
　　本試

4、驗旨在了解畜禽冷鮮肉和活蝦中弧菌的耐藥情況，并檢測超廣譜性β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs)耐藥基因在弧菌中的流行情況，為指導(dǎo)畜牧生產(chǎn)中β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的合理使用，減少其耐藥程度和控制其耐藥性的傳播擴散提供一定的理論依據(jù)。采用美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)推薦的瓊脂稀釋法檢測弧菌的耐藥性，發(fā)現(xiàn)所有弧菌對四環(huán)素、阿米卡星、美羅培南都敏感，但對氨芐西林、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑

5、、頭孢曲松、頭孢噻肟、萘啶酸、環(huán)丙沙星、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、氧氟沙星有不同程度的耐藥;其中13株副溶血性弧菌、6株溶藻弧菌、1株創(chuàng)傷弧菌對第三代頭孢耐藥。在副溶血性和溶藻弧菌中均發(fā)現(xiàn)blaper-1、blacmy-2和blaveb-1這3種ESBLs耐藥基因，而在創(chuàng)傷弧菌中僅發(fā)現(xiàn)blaper-1基因。綜上所述，分離自畜禽肉和活蝦中的弧菌具有不同程度的多種抗生素耐藥性，并攜帶多種ESBLs耐藥基因。
　　三、弧菌的PFGE

6、分型及質(zhì)粒溯源分析
　　細菌可通過質(zhì)粒對耐藥性基因進行水平傳播，本試驗旨在通過接合和轉(zhuǎn)化實驗說明質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs（超廣譜β-內(nèi)酰胺酶）耐藥基因的傳播性，通過PFGE來分析攜帶ESBLs基因弧菌的同源性，及對部分菌株質(zhì)粒序列的研究來探討質(zhì)粒溯源。結(jié)果表明，共16株弧菌接合成功，1株弧菌轉(zhuǎn)化成功，其接合和轉(zhuǎn)化的成功率在84％。在NotⅠ酶切后進行PFGE，11株副溶血性弧菌成功跑出條帶，其菌株條帶數(shù)在9-19之間，彼此之間相似度都

7、低于80％;6株溶藻弧菌跑出的條帶數(shù)在19-23之間，彼此之間相似度都低于74％;同時，通過S1酶切原菌及對應(yīng)的結(jié)合子或轉(zhuǎn)化子后進行PFGE，得到質(zhì)粒的數(shù)量和大小，然后通過southern雜交試驗驗證，確定不同質(zhì)粒攜帶ESBLs基因情況。在成功跑出S1-PFGE及雜交成功的結(jié)果中顯示:一株來自豬肉樣品的副溶血性弧菌VBT1中存在一個大小在120KB且攜帶blacmy-2基因的質(zhì)粒;一株來自蝦樣品的溶藻孤菌VBT24中存在一個大小在210