小鼠肝核苷酸池、核酸池的特征及其與纖維化的作用關系.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理基礎，是進一步向肝硬化發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，有關肝纖維化機理方面的研究無論是在細胞水平上還是在大分子水平上都已經(jīng)相當深入，但是在對于細胞代謝和生命活動有著重要影響的小分子及其與大分子作用關系方面的關注甚少，尤其是對于核苷酸池的性質(zhì)、動力學特征以及它與基因表達和纖維化進程的關系的研究尚屬空白。本研究探索了纖維化過程中核苷酸池的性質(zhì)、特點和動力學特征及其與病理過程和差異表達基因間的關系，同時也為纖維化及外源核苷酸緩

2、解纖維化進程的作用機理提供了新的認識。
　　采用CCl4誘導的方法建立肝纖維化小鼠模型，肝纖維化進程的衡量指標為AST、ALT酶活性和肝組織切片觀測。采用HPLC法系統(tǒng)地測定了纖維化過程中CCl4誘導的小鼠和正常小鼠細胞內(nèi)的核苷酸含量。有關CCl4誘導的纖維化小鼠的核酸池(代表性差異表達基因)數(shù)據(jù)是從Ensembl、BioGPS數(shù)據(jù)庫和文獻中收集整理的。采用熒光定量PCR技術測定了核苷酸三個代謝途徑的關鍵酶基因和7個小鼠肝纖維化相

3、關基因的表達水平。一磷酸核苷酸(NMP)的含量，AST/ALT的比值以及代表性差異表達基因數(shù)據(jù)用來分析核苷酸池、核酸池和纖維化進程三者之間的相關性。
　　酶活測定結果顯示處理組小鼠的AST、ALT酶活性持續(xù)下降，但都顯著高于對照組。從第8周開始，AST/ALT比值均大于1，指示肝損傷嚴重。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)從第4周開始，處理組有不同程度的肝纖維組織增生，纖維間隔形成，部分見假小葉形成，至第8周時，纖維化癥狀明顯，而對照組卻無明顯變化

4、。
　　HPLC測定的結果顯示處理組小鼠肝臟內(nèi)的核苷酸池的表現(xiàn)特征與對照組的存在顯著差別。處理組的核苷酸總含量和NMP含量在肝損傷早期顯著低于對照組，而在纖維化期顯著高于對照組。換言之，處理組小鼠中的核苷酸總含量和NMP的含量在持續(xù)增加，而對照組小鼠中的保持相對恒定。核苷酸池內(nèi)核苷酸含量大小關系為NMP>>NDP>NTP。
　　實驗中共測定了8種核苷酸：處理組的AMP含量呈上升趨勢，在第2周時顯著低于對照組(p<0.05)，

5、從第6周開始高于對照組，到第10周時達到顯著水平(p<0.01)；處理組的ADP含量在第2周時顯著低于對照組(p<0.01)，在第4周時開始上升，到第10周時顯著高于對照組(p<0.01)；ATP含量在處理組與對照組中沒有顯著性差異。處理組的GMP含量保持上升趨勢，在第2、4、8周與對照組無顯著性差異，在第6周和第10周顯著高于對照組(p<0.01)；處理組的GDP含量在第2、6、8周與對照組無顯著性差異，在第4周顯著低于對照組(p<0

6、.01)，第4周后上升，直至第10周顯著高于對照組(p<0.01)。處理組的UMP含量保持上升趨勢，在第2、4周顯著低于對照組(第2周，p<0.01；第4周，p<0.05)，第6、10周時顯著高于對照組(p<0.01)，第8周時與對照組無顯著性差異；處理組的UTP含量保持緩慢上升趨勢，在第2、8周顯著低于對照組(p<0.01)，第4、6、10周時與對照組無顯著性差異。處理組的CMP含量呈先上升、后稍微下降的變化趨勢，在第2、6周與對照組

7、沒有顯著性差異，在第4周顯著低于對照組(p<0.01)，此后上升，而到第8、10周時均顯著高于對照組(p<0.01)。
　　對差異表達基因的分析顯示肝纖維化小鼠模型中，在肝損傷早期下調(diào)的基因占主體，而在纖維化時期，表達上調(diào)的基因占大多數(shù)。這種變化趨勢與纖維化過程中肝組織的核苷酸池的變化相一致。相關性分析發(fā)現(xiàn)：NMP含量的變化值與相對應的差異表達基因的變化值存在顯著正相關關系，Pearson相關系數(shù)為0.961(雙尾檢驗)；NMP的

8、含量與纖維化指標(AST/ALT比值)也呈現(xiàn)顯著正相關關系，Pearson相關系數(shù)為0.930(雙尾檢驗)。
　　核苷酸代謝途徑的關鍵酶基因表達水平結果顯示從頭合成途徑和降解途徑的酶基因表達無明顯變化，而挽救途徑的腺嘌呤轉磷酸核糖基酶基因表達發(fā)生了變化；纖維化相關的7個基因的表達水平測定結果顯示它們的變化趨勢與已報道的文獻中的結果基本一致。
　　肝臟內(nèi)的核苷酸池對于肝臟的生理狀態(tài)有著明顯的影響，核苷酸池和核酸池間的相互作用對