SIRT1在小鼠肝纖維化中的作用及其相關(guān)分子的組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　1.建立SIRT1肝臟特異性敲除（liver-specific knockout of SIRT1,SIRT1-LKO）小鼠模型；
　　2.觀察SIRT1-LKO及其同窩野生型（wild type,WT）小鼠在四氯化碳（carbon tetrachloride,CCL4）誘導(dǎo)下的肝纖維化情況；
　　3.篩選肝纖維化中與SIRT1相關(guān)的差異分子，系統(tǒng)地探討他們?cè)诟卫w維化中可能的作用；4.觀察白藜蘆醇（resv

2、eratrol,RES）對(duì)小鼠肝纖維化的保護(hù)作用。
　　方法：
　　1.利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)構(gòu)建SIRT1-LKO小鼠模型，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR）驗(yàn)證小鼠肝組織中SIRT1基因表達(dá)水平，Western Blot和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證SIRT1蛋白表達(dá)水平。
　　2.經(jīng)腹腔

3、注射CCL4橄欖油溶液來誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，通過血清生化檢測(cè)肝功能，使用Sirius red染色觀察肝臟中的膠原纖維，免疫組織化學(xué)和WesternBlot檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表達(dá)來觀察肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells,HSCs）活化。
　　3.利用基因芯片技術(shù)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem m

4、ass spectrometry,LC-MS/MS）技術(shù)，檢測(cè)SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠在CCL4和橄欖油兩種不同處理因素下的基因和蛋白表達(dá)水平，依據(jù)纖維化造模結(jié)果制定篩選原則，篩選差異分子，采用DAVID Bioinformatics Resources6.7系統(tǒng)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)鎖定候選分子并進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證。
　　4.經(jīng)腹腔注射CCL4橄欖油溶液來誘導(dǎo)小鼠肝纖維化，同時(shí)腹腔注射白藜蘆醇二甲基亞砜（

5、dimethyl sulphoxide,DMSO）溶液，通過血清生化檢測(cè)肝功能，采用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察肝組織形態(tài)，Masson三色染色觀察肝臟膠原纖維。
　　結(jié)果：
　　1.通過對(duì)小鼠繁育、雜交和鑒定，我們成功建立了SIRT1-LKO小鼠模型，并獲得了其同窩對(duì)照WT小鼠。
　　2.造模8周后，腹腔注射20％ CCL4橄欖油溶液的SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠的血清丙氨酸氨

6、基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate transaminase,AST）水平較單純注射橄欖油組顯著升高（P＜0.01），肝臟中膠原纖維增加，α-SMA蛋白表達(dá)水平升高；更為重要的是，我們首次發(fā)現(xiàn)同在CCL4誘導(dǎo)下，SIRT1-LKO小鼠較同窩WT小鼠的肝損傷和肝纖維化程度更加嚴(yán)重（P＜0.05）。
　　3.通過對(duì)差異分子（倍數(shù)差異＞2）進(jìn)行篩選和生物信息學(xué)分

7、析，從mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)了一組SIRT1參與肝纖維化的相關(guān)分子，并對(duì)其中8個(gè)候選分子（AFP、OIP5、CCNB2、FHL2、GPC3、POC1A、CCNB1和PHGDH）進(jìn)行了Q-PCR驗(yàn)證，結(jié)果與基因芯片基本一致。
　　4.造模8周后，CCL4組小鼠的血清ALT和AST水平較橄欖油組顯著升高（P＜0.01），肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，肝臟中膠原纖維增加，而同時(shí)注射白藜蘆醇DMSO溶液的小鼠肝損傷和纖維化程度明顯減輕（P＜0