產(chǎn)GSH釀酒酵母的微生物育種.pdf

1、谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的活性三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸三種氨基酸組成,具有重要的生理功能,廣泛分布于動植物細胞和微生物細胞中。谷胱甘肽具有清除自由基、解毒、延緩衰老和抗疲勞等多種生理功效。在臨床上用于肝臟保護、治療腫瘤和內(nèi)分泌紊亂等疾病。谷胱甘肽的生產(chǎn)方法有多種,目前生產(chǎn)上最常用的是發(fā)酵法。
　　發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的基礎(chǔ)是選育一株穩(wěn)定高產(chǎn)的優(yōu)良菌株。基因組重排育種技術(shù)是在上個世紀(jì)

2、90年代被提出,該技術(shù)將傳統(tǒng)誘變育種與原生質(zhì)體融合技術(shù)有機結(jié)合,大大加快菌株正向突變的進程。國內(nèi)學(xué)者針對這種技術(shù)的研究還比較少,在選育谷胱甘肽高產(chǎn)菌株方面還沒有相關(guān)的文獻記載。
　　本文采用基因組重排育種技術(shù)對釀酒酵母進行微生物育種,旨在選育出高產(chǎn)、生長周期短、生產(chǎn)性能穩(wěn)定的高產(chǎn)GSH優(yōu)良菌株。研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1、將現(xiàn)有保藏的產(chǎn)GSH菌株活化后,經(jīng)10次傳代培養(yǎng)篩選出相對高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定的菌株編號Y1和Y2作為

3、出發(fā)菌株,Y1和Y2的GSH產(chǎn)量分別為261.47mg/L和600.13 mg/L。對釀酒酵母Y1和Y2單倍體制備條件進行了研究。確定了單倍體制備條件:Y1和Y2分別用2％和1.5%蝸牛酶作用75min和90min,酶解后55℃分別加熱8min和10min,單倍體制備率均達到100%。
　　2、通過探究了單倍體Y1-110和Y2-206原生質(zhì)體形成與再生的影響因素,確定了單倍體Y1-110和Y2-206原生質(zhì)體制備的條件為:Y1-

4、110和Y2-206的菌懸液分別預(yù)處理20min和25min,滲透壓濃度分別為0.45mol/L和0.50mol/L,2%蝸牛酶+1%纖維素酶共同酶解時間分別為3h和4h,其原生質(zhì)體形成率分別為88.02%和90.00%,再生率分別為51.70%和47.86%。
　　3、進行了基因組重排實驗,利用原生質(zhì)體滅活的篩選方法進行目的融合菌株的篩選。確定了原生質(zhì)體滅活的條件分別為:Y1-110和Y2-206的原生質(zhì)體熱滅活處理條件分別為6

5、5℃處理3min和5min,紫外滅活處理時間分別為90s和120s。原生質(zhì)體融合的最佳條件為:在28~30℃下,用35%的PEG6000處理120min,融合率達到3.23×10-4%。在進行了三輪基因組重排、抗性篩選及遺傳穩(wěn)定性篩選后,得到一株穩(wěn)定高產(chǎn)的抗ZnCl2重排菌株YR-1,其GSH產(chǎn)量為679.95mg/L,比Y1產(chǎn)量提高了160.05%,比Y2提高了13.30%。非基因組重排對照實驗也證明了F3代的優(yōu)良表型確實是通過基因組

6、重排育種技術(shù)實現(xiàn)的。
　　4、通過單因素實驗和正交試驗對重排菌株YR-1的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖4.6%、酵母粉2.4%,磷酸氫二鉀0.21%,磷酸二氫鉀0.30%,硫酸鎂0.05%,發(fā)酵GSH產(chǎn)量達到730.12mg/L,比原始重排菌株GSH產(chǎn)量提高了7.38%。初步確定最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度28℃,初始pH值5.5,接種量10%,裝液量30mL/250mL,搖床轉(zhuǎn)速120r/min,