產(chǎn)香葉醇的釀酒酵母代謝工程.pdf

1、萜類(lèi)化合物是一類(lèi)主要來(lái)源于植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)上通常為異戊二烯單元倍數(shù)及其含氧衍生物。萜類(lèi)化合物廣泛應(yīng)用于藥品、食品、香料和化妝品行業(yè)，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。合成生物學(xué)的發(fā)展使得利用微生物生產(chǎn)萜類(lèi)化合物成為一種更加簡(jiǎn)單、高效和節(jié)約成本的生產(chǎn)方式。本論文以分子生物學(xué)技術(shù)為手段構(gòu)建了一系列釀酒酵母整合載體，利用基因組整合的方式對(duì)釀酒酵母的類(lèi)異戊二烯代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，增加各個(gè)階段前體物質(zhì)供應(yīng)，進(jìn)而提高工程酵母萜類(lèi)化合物的產(chǎn)量。在引入無(wú)環(huán)單萜

2、香葉醇合成酶基因后，代謝工程改造的釀酒酵母工程菌株的香葉醇產(chǎn)量相比于原始菌株有了較大程度的提高，為萜類(lèi)化合的生物合成打下了基礎(chǔ)，研究取得的主要結(jié)論如下:
　　(1)本文以Gal1/Gal10雙向表達(dá)穿梭載體pCTCON-dual-intra-Metab v1為基礎(chǔ)載體，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的能夠使整合基因高效表達(dá)的釀酒酵母基因組整合位點(diǎn)選擇合適的整合位點(diǎn)構(gòu)建了一系列釀酒整合載體，pINT1-TRP1-ERG8-ERG19-24REC、pI

3、NT1-URA3-ERG13-ERG10-20REC、pINT1-HIS3-mvaA-ERG12-21REC、pINT1-LEU2-ERG20-IDI1-19REC。這一系列載體可以在線性化后整合至釀酒酵母基因組用于代謝工程改造，也可以在更換代謝調(diào)控基因后在釀酒酵母中整合表達(dá)并穩(wěn)定遺傳，為釀酒酵母代謝工程改造提供了基礎(chǔ)。
　　(2)本研究以釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤(pán)生物，將上述構(gòu)建的釀酒酵母整合表達(dá)載體依次整合至釀酒基因組

4、得到了一系列代謝工程改造的菌株。工程酵母的整合基因相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果顯示目的基因ERG8、ERG19、ERG13、ERG10、mvaA、ERG12、ERG20和IDI1相對(duì)于原始菌的表達(dá)量分別提高了18.51倍、18.38倍、8.40倍、8.75倍、1472667.19倍、372.22倍、160.90倍和91.77倍。
　　(3)為了研究代謝工程改造后的工程酵母合成萜類(lèi)化合物的能力是否相對(duì)于原始菌有所提高，在原始菌和代謝工程改造的