RNAi技術(shù)在黃瓜抗根結(jié)線蟲(chóng)遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究.pdf

1、根結(jié)線蟲(chóng)在引起黃瓜侵染性病害的四大病原中,正逐漸成為僅次于真菌、細(xì)菌病害的一類(lèi)重要的植物病原物。黃瓜根結(jié)線蟲(chóng)病已成為影響黃瓜生產(chǎn)較突出的問(wèn)題.根結(jié)線蟲(chóng)的防治方法包括栽培防病、化學(xué)防病和抗線蟲(chóng)品種培育?？咕€蟲(chóng)品種培育一直是育種家追尋的理想途徑,但由于種質(zhì)資源的匱乏,僅靠現(xiàn)有資源和常規(guī)育種方法很難育出抗線蟲(chóng)的黃瓜品種。 利用生物技術(shù)輔助傳統(tǒng)育種是解決抗源匱乏的有效途徑。通過(guò)基因工程提高植物抗逆性技術(shù)早已在黃瓜育種中探索應(yīng)用。RNA干

2、擾(RNAi)是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,是一種由同源序列引發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。由于黃瓜組織培養(yǎng)困難,再生率較低,再生周期長(zhǎng),因而很少生物技術(shù)工作者選擇黃瓜作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。因此,本試驗(yàn)著重開(kāi)展了黃瓜高效植株再生體系的研究,黃瓜抗根結(jié)線蟲(chóng)RNAi載體的構(gòu)建,農(nóng)桿菌介導(dǎo)和花粉管導(dǎo)入技術(shù)轉(zhuǎn)化黃瓜的研究,研究結(jié)果如下： (1) 篩選出較為優(yōu)化的黃瓜再生體系。取材時(shí)間以播種2天苗齡的子葉為最佳接種苗齡；取材部位以近葉柄端子葉為最佳再

3、生外植體材料：最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS+6-BA 1 mg·L-1+ABA 1 mg·L-1+Ades20 mg'L-1;培養(yǎng)早期Ades和ABA的存在能降低POD的含量,促進(jìn)不定芽的再生。 (2) 構(gòu)建了抗根結(jié)線蟲(chóng)的RNAi表達(dá)載體。提取帶有根結(jié)線蟲(chóng)的黃瓜根系總RNA,利用RT-PCR擴(kuò)增出根結(jié)線蟲(chóng)保守基因16D10,連接到T載體pMD-18上,測(cè)序表明所擴(kuò)增的序列與已發(fā)表的四種主要根結(jié)線蟲(chóng)(南方根結(jié)線蟲(chóng)、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)

4、線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng))序列具有很高的同源性,然后將16D10基因正向和反向插入到pBLUE載體上,構(gòu)建了雙鏈載體pBLUE-22-21,并將此雙鏈基因插入到由35S啟動(dòng)子調(diào)控的克隆載體pRTL2上,命名為pRTL2-22-21,再將含有啟動(dòng)子和終止子以及雙鏈的目的片段插入到雙元表達(dá)載體pBIN-19上,得到表達(dá)載體pBIN-22-21。 (3) 研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化因素。不同基因型黃瓜品種對(duì)抗性芽數(shù)影響很大,魯黃瓜8

5、號(hào)適合作為轉(zhuǎn)化材料；不同發(fā)育時(shí)期的子葉直接誘導(dǎo)黃瓜抗性芽的潛能不同,當(dāng)兩片子葉將要脫離種殼,子葉露出部分為綠色時(shí)進(jìn)行外植體切割產(chǎn)生的抗性芽多；黃瓜對(duì)Kan較敏感,采用延遲篩選法進(jìn)行篩選；同一濃度的Carb和Cef對(duì)黃瓜芽分化沒(méi)有明顯的差異,但綜合抑菌效果,選擇Cef 300 mg·L-1或者是Carb500 mg·L-1作為抑菌劑。 (4) 研究了花粉管通道法介導(dǎo)的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化。不同注射方法影響坐果率,采用授粉后24 h后用刀片