互葉白千層精油對儲糧害蟲的殺蟲活性及作用機制.pdf

1、雜擬谷盜和玉米象是重要的儲糧害蟲，造成儲糧巨大損失，化學熏蒸劑的使用受到毒性和環(huán)境安全的嚴重制約。研發(fā)高效安全的儲糧害蟲控制藥劑在實踐中具有重要的意義。本論文研究了互葉白千層精油對雜擬谷盜（Tribolium confusum Jac.du Val.）、玉米象（Sitophiluszeamais）等儲糧害蟲的殺蟲活性，明確了互葉白千層精油的主要殺蟲活性成分，探討了互葉白千層精油對儲糧害蟲殺蟲作用的生化機理和分子機制，開展了互葉白千層精油

2、防治儲糧害蟲的實倉模擬試驗，并對互葉白千層精油安全性進行了初步評價，為植物源農藥的研究開發(fā)、儲糧害蟲的綠色防控以及保障農產品質量安全提供技術支撐。主要研究結果如下:
　　1、互葉白千層精油對儲糧害蟲的殺蟲作用
　　以儲糧害蟲雜擬谷盜和玉米象為研究對象，研究了不同濃度和時間梯度的互葉白千層精油對供試昆蟲的驅避作用、觸殺作用和熏蒸作用，旨在探討不同作用方式的互葉白千層精油對試蟲的殺蟲活性效果。結果表明:互葉白千層精油對雜擬谷盜和

3、玉米象的驅避效果明顯，在濃度為1.41mg/cm2下對雜擬谷盜和玉米象的平均驅避率分別是77.60％、75.68％，其驅避等級達Ⅳ級;互葉白千層精油對雜擬谷盜和玉米象都具有良好的觸殺作用，24h時其觸殺活性的LD50分別為4.70mg/cm2、4.80mg/cm2;互葉白千層精油的熏蒸作用效果顯著，具有進一步開發(fā)的價值，其對雜擬谷盜成蟲處理24h、48h、72h后的LC50分別為7.45mg/L、7.09mg/L和6.37 mg/L，對

4、玉米象成蟲處理24h、48h、72h后的LC50分別為8.42mg/L、7.70mg/L和6.78mg/L。可見互葉白千層精油應用于儲糧害蟲的防治具有可行性。
　　2、互葉白千層精油的殺蟲活性成分分析
　　利用GC-MS技術對互葉白千層精油的揮發(fā)性成分進行分析，并以峰面積歸一化法測定各成分的相對含量。GC-MS主要鑒定出10種主要成分，分別是α-蒎烯(α-pinene)、檜烯(sabinene)、α-松油烯(α-terpin

5、ene)、對傘花烴(p-cymene)、芋烯(limonene)、1，8-桉葉油素(1，8-cineole)、γ-松油烯(γ-terpinene)、異松油烯(terpinolene)、4-松油醇（terpinen-4-ol）和α-松油醇(α-terpineol)。定量分析表明互葉白千層精油的主要成分多為萜類化合物，其中4-松油醇的含量高達40.09％，說明該精油為4-松油醇型。
　　根據(jù)GC-MS分析結果，實驗選取其中含量較高的五

6、種成分進行活性研究。結果顯示各成分均具有良好的熏蒸毒力，其熏蒸毒力大小為:4-松油醇＞α-松油醇＞1，8-桉葉油素＞γ-松油烯＞α-松油烯。其中4-松油醇和α-松油醇熏蒸效果顯著，尤其4-松油醇熏蒸效果突出，其對雜擬谷盜和玉米象熏蒸作用的LC50分別為3.22mg/L和3.83 mg/L，具有進一步開發(fā)為儲糧害蟲熏蒸劑的潛能。
　　3、互葉白千層精油對儲糧害蟲熏蒸作用生化機理的探討
　　采用三角瓶熏蒸法處理試蟲后測定其體內乙

7、酰膽堿酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)和羧酸酯酶(CarE)酶的活性，旨在從生化水平探討互葉白千層精油對試蟲熏蒸作用的機理。結果表明:分別用雜擬谷盜和玉米象的致死中濃度(7.45mg/L、8.42mg/L)熏蒸處理24h后，兩種儲糧害蟲體內AChE、GST和CarE酶活力均受到抑制，且隨著時間的延長，三種酶活力都有一定程度的恢復趨勢，雖有些波動，但整體均顯著低于對照的酶活力;而在熏蒸12h時，玉米象體內CarE酶活力受到

8、互葉白千層精油脅迫而產生應激反應。低濃度處理(5.39 mg/L)24h后，雜擬谷盜體內GST酶和玉米象體內CarE酶活力受到互葉白千層精油脅迫而產生應激反應，玉米象體內AChE活力與空白對照組AChE的酶活力基本相同，表現(xiàn)出對AChE的酶活力無影響，而隨著處理劑量的升高，抑制作用增加;其中玉米象的CarE酶活力在7.48mg/L濃度精油熏蒸下產生了一定的應激反應，但仍然顯著低于對照，表現(xiàn)出抑制作用。
　　4、互葉白千層精油對儲糧

9、害蟲熏蒸作用的轉錄組測序與分析
　　使用Illumina Hiseq平臺首次對雜擬谷盜和玉米象進行轉錄組測序，分別獲得雜擬谷盜(8.96Gb)和玉米象(8.93 Gb)的原始數(shù)據(jù)。其中，雜擬谷盜對照組和處理組分別獲得45，114，010和44，228，536 clean reads，玉米象對照組和處理組分別獲得44，697，706和44，884，212 clean reads。經(jīng)Trinity軟件組裝最終分別獲得28，885和33

10、，483個Unigene，平均長度分別為944nt和1，280nt。通過將Unigene分別比對到Nr、Nt、Swissprot、COG、KEGG、GO和Interpro等七大蛋白質公共數(shù)據(jù)庫進行注釋，分別共有23，571(81.60％)、20，811(62.15％)條Unigene獲得功能注釋。通過比較處理組和對照組的轉錄組數(shù)據(jù)，分別發(fā)現(xiàn)2，208和3，562個差異表達基因，其中雜擬谷盜有999個基因上調，1，209個基因下調;玉米象

11、有2，836個基因上調，726個基因下調。進一步對差異表達基因進行分析，包括GO分析和KEGG pathway富集分析，結果顯示:GO功能分析中，Unigenes主要被分類到細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學過程(biological process)三大類的47類詳細GO功能類別中。Pathway功能分析中，雜擬谷盜有18，074條Unigene被均注釋到42條K

12、EGG代謝通路中。獲得1，751條pathway的富集數(shù)據(jù)，其中顯著性富集(Qvalue≤0.05，Pvalue≤0.05)的pathway有23條。在玉米象轉錄組數(shù)據(jù)庫中，有15，074、18，074條Unigene被注釋到42條KEGG代謝通路中，獲得2，456條pathway的富集數(shù)據(jù)。其中顯著性富集的pathway有15條。根據(jù)GO和pathway代謝通路富集分析預測和確定了顯著性富集的信號傳導途徑，包括線粒體電子傳遞、代謝途徑

13、、甾類激素的生物合成和神經(jīng)遞質代謝等信號通路。結果表明互葉白千層精油的作用靶標可能是呼吸鏈，此外解毒代謝酶細胞色素P450、羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉移酶參與了降解、代謝互葉白千層精油的化學成分等反應。
　　對雜擬谷盜和玉米象進行qRT-PCR內參基因選擇。從轉錄組數(shù)據(jù)庫中挑選15個上調或下調的差異表達基因，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)為內

14、參基因，采用△△CT法計算相關基因的表達水平，結果顯示:定量PCR測定結果與轉錄組測序數(shù)據(jù)分析結果一致。
　　5、互葉白千層精油安全性的初步評價
　　對互葉白千層精油進行大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入和家兔眼刺激、皮膚刺激及豚鼠皮膚變態(tài)反應等的毒性試驗，對其安全性進行了初步評價。急性經(jīng)口毒性試驗中，互葉白千層精油對大鼠急性經(jīng)口LD50雌性為1710mg/kg b.wt.，雄性為1470mg/kgb.Wt.，均屬低等毒類。急性經(jīng)皮毒

15、性試驗中，互葉白千層精油對大鼠對大鼠急性經(jīng)皮LD50雌性為3160mg/kg b.wt.、雄性為4300mg/kg b.wt.，均屬低等毒類。急性吸入毒性試驗中，互葉白千層精油對大鼠的急性吸入LC50(2h)雌、雄性均大于5000 mg/m3，屬微毒類。急性皮膚刺激試驗中，互葉白千層精油對大鼠家兔皮膚刺激反應積分為2.5，7天恢復正常，屬中等刺激性。急性眼刺激試驗中，互葉白千層精油對家兔未沖洗時急性眼刺激積分指數(shù)為7.5，平均指數(shù)為1.

16、0（4天后小于5），7天恢復正常，屬輕度至中度刺激性;4s沖洗時急性眼刺激積分指數(shù)為4.0，平均指數(shù)為0.0(48小時后為0)，48小時恢復正常，屬無刺激性;30s沖洗時急性眼刺激積分指數(shù)為4.0，平均指數(shù)為2.5（48小時后小于5），72小時恢復正常，屬輕度刺激性。皮膚變態(tài)反應試驗中，互葉白千層精油對豚鼠致敏率為66.67％，具有一定的致敏性。根據(jù)以上結果，認為互葉白千層精油急性毒性低，該物質安全性良好，可對其進行下一階段的遺傳毒性試

17、驗。
　　6、互葉白千層精油防治儲糧害蟲的實倉模擬試驗
　　在小麥模擬實倉試驗中，互葉白千層精油分別設置了不同的濃度梯度和時間梯度測試，測試了其對雜擬谷盜和玉米象的實倉殺蟲效果。實倉模擬試驗結果顯示:在28℃、20d黑暗條件下，互葉白千層精油對上層的雜擬谷盜和玉米象均具有良好的實倉熏蒸效果，對下層兩種害蟲的熏蒸效果一般。使用劑量為598.50mg/L時，上層和下層小麥中雜擬谷盜的死亡率分別為68.34％、40.00％，其熏蒸

18、作用的LC50分別為373.45mg/L、748.66mg/L;上層和下層小麥中玉米象的死亡率分別為90.00％、51.67％，其熏蒸作用的LC50分別為290.35mg/L、566.80mg/L。在28℃黑暗條件下，使用598.50mg/L的劑量分別密閉熏蒸1d、7d、14d和20d后，其實倉熏蒸效果隨時間的延長而逐漸增強，14d后對雜擬谷盜和玉米象上層的熏蒸毒力分別為52.34％和72.67％，下層分別為31.67％和42.34％，