互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲的殺蟲活性及作用機(jī)制.pdf

1、雜擬谷盜和玉米象是重要的儲(chǔ)糧害蟲，造成儲(chǔ)糧巨大損失，化學(xué)熏蒸劑的使用受到毒性和環(huán)境安全的嚴(yán)重制約。研發(fā)高效安全的儲(chǔ)糧害蟲控制藥劑在實(shí)踐中具有重要的意義。本論文研究了互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜（Tribolium confusum Jac.du Val.）、玉米象（Sitophiluszeamais）等儲(chǔ)糧害蟲的殺蟲活性，明確了互葉白千層精油的主要?dú)⑾x活性成分，探討了互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲殺蟲作用的生化機(jī)理和分子機(jī)制，開展了互葉白千層精油

2、防治儲(chǔ)糧害蟲的實(shí)倉模擬試驗(yàn)，并對(duì)互葉白千層精油安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，為植物源農(nóng)藥的研究開發(fā)、儲(chǔ)糧害蟲的綠色防控以及保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:
　　1、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲的殺蟲作用
　　以儲(chǔ)糧害蟲雜擬谷盜和玉米象為研究對(duì)象，研究了不同濃度和時(shí)間梯度的互葉白千層精油對(duì)供試?yán)ハx的驅(qū)避作用、觸殺作用和熏蒸作用，旨在探討不同作用方式的互葉白千層精油對(duì)試蟲的殺蟲活性效果。結(jié)果表明:互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜和

3、玉米象的驅(qū)避效果明顯，在濃度為1.41mg/cm2下對(duì)雜擬谷盜和玉米象的平均驅(qū)避率分別是77.60％、75.68％，其驅(qū)避等級(jí)達(dá)Ⅳ級(jí);互葉白千層精油對(duì)雜擬谷盜和玉米象都具有良好的觸殺作用，24h時(shí)其觸殺活性的LD50分別為4.70mg/cm2、4.80mg/cm2;互葉白千層精油的熏蒸作用效果顯著，具有進(jìn)一步開發(fā)的價(jià)值，其對(duì)雜擬谷盜成蟲處理24h、48h、72h后的LC50分別為7.45mg/L、7.09mg/L和6.37 mg/L，對(duì)

4、玉米象成蟲處理24h、48h、72h后的LC50分別為8.42mg/L、7.70mg/L和6.78mg/L?？梢娀ト~白千層精油應(yīng)用于儲(chǔ)糧害蟲的防治具有可行性。
　　2、互葉白千層精油的殺蟲活性成分分析
　　利用GC-MS技術(shù)對(duì)互葉白千層精油的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并以峰面積歸一化法測定各成分的相對(duì)含量。GC-MS主要鑒定出10種主要成分，分別是α-蒎烯(α-pinene)、檜烯(sabinene)、α-松油烯(α-terpin

5、ene)、對(duì)傘花烴(p-cymene)、芋烯(limonene)、1，8-桉葉油素(1，8-cineole)、γ-松油烯(γ-terpinene)、異松油烯(terpinolene)、4-松油醇（terpinen-4-ol）和α-松油醇(α-terpineol)。定量分析表明互葉白千層精油的主要成分多為萜類化合物，其中4-松油醇的含量高達(dá)40.09％，說明該精油為4-松油醇型。
　　根據(jù)GC-MS分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)選取其中含量較高的五

6、種成分進(jìn)行活性研究。結(jié)果顯示各成分均具有良好的熏蒸毒力，其熏蒸毒力大小為:4-松油醇＞α-松油醇＞1，8-桉葉油素＞γ-松油烯＞α-松油烯。其中4-松油醇和α-松油醇熏蒸效果顯著，尤其4-松油醇熏蒸效果突出，其對(duì)雜擬谷盜和玉米象熏蒸作用的LC50分別為3.22mg/L和3.83 mg/L，具有進(jìn)一步開發(fā)為儲(chǔ)糧害蟲熏蒸劑的潛能。
　　3、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧害蟲熏蒸作用生化機(jī)理的探討
　　采用三角瓶熏蒸法處理試蟲后測定其體內(nèi)乙

7、酰膽堿酯酶(AChE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和羧酸酯酶(CarE)酶的活性，旨在從生化水平探討互葉白千層精油對(duì)試蟲熏蒸作用的機(jī)理。結(jié)果表明:分別用雜擬谷盜和玉米象的致死中濃度(7.45mg/L、8.42mg/L)熏蒸處理24h后，兩種儲(chǔ)糧害蟲體內(nèi)AChE、GST和CarE酶活力均受到抑制，且隨著時(shí)間的延長，三種酶活力都有一定程度的恢復(fù)趨勢，雖有些波動(dòng)，但整體均顯著低于對(duì)照的酶活力;而在熏蒸12h時(shí)，玉米象體內(nèi)CarE酶活力受到

8、互葉白千層精油脅迫而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。低濃度處理(5.39 mg/L)24h后，雜擬谷盜體內(nèi)GST酶和玉米象體內(nèi)CarE酶活力受到互葉白千層精油脅迫而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，玉米象體內(nèi)AChE活力與空白對(duì)照組AChE的酶活力基本相同，表現(xiàn)出對(duì)AChE的酶活力無影響，而隨著處理劑量的升高，抑制作用增加;其中玉米象的CarE酶活力在7.48mg/L濃度精油熏蒸下產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng)，但仍然顯著低于對(duì)照，表現(xiàn)出抑制作用。
　　4、互葉白千層精油對(duì)儲(chǔ)糧

9、害蟲熏蒸作用的轉(zhuǎn)錄組測序與分析
　　使用Illumina Hiseq平臺(tái)首次對(duì)雜擬谷盜和玉米象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得雜擬谷盜(8.96Gb)和玉米象(8.93 Gb)的原始數(shù)據(jù)。其中，雜擬谷盜對(duì)照組和處理組分別獲得45，114，010和44，228，536 clean reads，玉米象對(duì)照組和處理組分別獲得44，697，706和44，884，212 clean reads。經(jīng)Trinity軟件組裝最終分別獲得28，885和33

10、，483個(gè)Unigene，平均長度分別為944nt和1，280nt。通過將Unigene分別比對(duì)到Nr、Nt、Swissprot、COG、KEGG、GO和Interpro等七大蛋白質(zhì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，分別共有23，571(81.60％)、20，811(62.15％)條Unigene獲得功能注釋。通過比較處理組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別發(fā)現(xiàn)2，208和3，562個(gè)差異表達(dá)基因，其中雜擬谷盜有999個(gè)基因上調(diào)，1，209個(gè)基因下調(diào);玉米象

11、有2，836個(gè)基因上調(diào)，726個(gè)基因下調(diào)。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，包括GO分析和KEGG pathway富集分析，結(jié)果顯示:GO功能分析中，Unigenes主要被分類到細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學(xué)過程(biological process)三大類的47類詳細(xì)GO功能類別中。Pathway功能分析中，雜擬谷盜有18，074條Unigene被均注釋到42條K

12、EGG代謝通路中。獲得1，751條pathway的富集數(shù)據(jù)，其中顯著性富集(Qvalue≤0.05，Pvalue≤0.05)的pathway有23條。在玉米象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，有15，074、18，074條Unigene被注釋到42條KEGG代謝通路中，獲得2，456條pathway的富集數(shù)據(jù)。其中顯著性富集的pathway有15條。根據(jù)GO和pathway代謝通路富集分析預(yù)測和確定了顯著性富集的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括線粒體電子傳遞、代謝途徑

13、、甾類激素的生物合成和神經(jīng)遞質(zhì)代謝等信號(hào)通路。結(jié)果表明互葉白千層精油的作用靶標(biāo)可能是呼吸鏈，此外解毒代謝酶細(xì)胞色素P450、羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶參與了降解、代謝互葉白千層精油的化學(xué)成分等反應(yīng)。
　　對(duì)雜擬谷盜和玉米象進(jìn)行qRT-PCR內(nèi)參基因選擇。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中挑選15個(gè)上調(diào)或下調(diào)的差異表達(dá)基因，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)

14、參基因，采用△△CT法計(jì)算相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:定量PCR測定結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。
　　5、互葉白千層精油安全性的初步評(píng)價(jià)
　　對(duì)互葉白千層精油進(jìn)行大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮、吸入和家兔眼刺激、皮膚刺激及豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)等的毒性試驗(yàn)，對(duì)其安全性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)大鼠急性經(jīng)口LD50雌性為1710mg/kg b.wt.，雄性為1470mg/kgb.Wt.，均屬低等毒類。急性經(jīng)皮毒

15、性試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)大鼠對(duì)大鼠急性經(jīng)皮LD50雌性為3160mg/kg b.wt.、雄性為4300mg/kg b.wt.，均屬低等毒類。急性吸入毒性試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)大鼠的急性吸入LC50(2h)雌、雄性均大于5000 mg/m3，屬微毒類。急性皮膚刺激試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)大鼠家兔皮膚刺激反應(yīng)積分為2.5，7天恢復(fù)正常，屬中等刺激性。急性眼刺激試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)家兔未沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為7.5，平均指數(shù)為1.

16、0（4天后小于5），7天恢復(fù)正常，屬輕度至中度刺激性;4s沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為4.0，平均指數(shù)為0.0(48小時(shí)后為0)，48小時(shí)恢復(fù)正常，屬無刺激性;30s沖洗時(shí)急性眼刺激積分指數(shù)為4.0，平均指數(shù)為2.5（48小時(shí)后小于5），72小時(shí)恢復(fù)正常，屬輕度刺激性。皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中，互葉白千層精油對(duì)豚鼠致敏率為66.67％，具有一定的致敏性。根據(jù)以上結(jié)果，認(rèn)為互葉白千層精油急性毒性低，該物質(zhì)安全性良好，可對(duì)其進(jìn)行下一階段的遺傳毒性試

17、驗(yàn)。
　　6、互葉白千層精油防治儲(chǔ)糧害蟲的實(shí)倉模擬試驗(yàn)
　　在小麥模擬實(shí)倉試驗(yàn)中，互葉白千層精油分別設(shè)置了不同的濃度梯度和時(shí)間梯度測試，測試了其對(duì)雜擬谷盜和玉米象的實(shí)倉殺蟲效果。實(shí)倉模擬試驗(yàn)結(jié)果顯示:在28℃、20d黑暗條件下，互葉白千層精油對(duì)上層的雜擬谷盜和玉米象均具有良好的實(shí)倉熏蒸效果，對(duì)下層兩種害蟲的熏蒸效果一般。使用劑量為598.50mg/L時(shí)，上層和下層小麥中雜擬谷盜的死亡率分別為68.34％、40.00％，其熏蒸

18、作用的LC50分別為373.45mg/L、748.66mg/L;上層和下層小麥中玉米象的死亡率分別為90.00％、51.67％，其熏蒸作用的LC50分別為290.35mg/L、566.80mg/L。在28℃黑暗條件下，使用598.50mg/L的劑量分別密閉熏蒸1d、7d、14d和20d后，其實(shí)倉熏蒸效果隨時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，14d后對(duì)雜擬谷盜和玉米象上層的熏蒸毒力分別為52.34％和72.67％，下層分別為31.67％和42.34％，