人組織因子途徑抑制物-2的結(jié)構(gòu)1,3和C端的表達(dá)、純化和結(jié)構(gòu)功能研究.pdf

1、組織因子途徑抑制物—2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2),是一種帶有kunitz型結(jié)構(gòu)域的蛋白酶抑制劑。成熟的hTFPI-2(human TFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串聯(lián)的三個(gè)kunitz結(jié)構(gòu)域和富含堿性氨基酸的C端組成。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等多種蛋白酶的活性。研究表明hTFPI-2能夠抑制乳腺癌、前列腺癌

2、、肺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等多種惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移,也能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脫落。因此,hTFPI-2有可能作為一種新型蛋白質(zhì)藥物,在治療腫瘤轉(zhuǎn)移和動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥方面具有潛在的應(yīng)用前景。但目前對(duì)hTFPI-2結(jié)構(gòu)功能的了解還不十分清楚,極大地妨礙了它的應(yīng)用。
　　 第一個(gè)結(jié)構(gòu)域(hTFPI-2/KD1)是hTFPI-2發(fā)揮對(duì)多種蛋白酶抑制活性的關(guān)鍵部位。所以對(duì)hTFPI-2/KD1的結(jié)構(gòu),功能及其關(guān)系的研究顯

3、得尤為重要。本論文利用傅立葉紅外光譜、圓二色譜和拉曼光譜研究了hTFPI-2/KD1的二級(jí)結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)hTFPI-2/KD1含有約17％α-螺旋,24％β-伸展鏈,46％無規(guī)卷曲,13％的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu),以及ggg和tgt兩種結(jié)構(gòu)的二硫鍵。通過對(duì)hTFPI-2/KD1的光譜隨溫度變化情況的研究,我們發(fā)現(xiàn)hTFPI-2/KD1具有一定的熱穩(wěn)定性。在高溫下hTFPI-2/KD1可以轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N中間態(tài),當(dāng)溫度降低后又變回到正常構(gòu)型。對(duì)hTFPI-2

4、/KD1的生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了hTFPI-2/KD1在80℃下孵育5 min再恢復(fù)到室溫后,仍保持了原有抑制纖溶酶的活性。
　　 本論文還探索了采用酵母表達(dá)系統(tǒng)制備hTFPI-2第三個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域及C端(hTFPI-2/KD3C)的工藝路線。在突變了糖基化位點(diǎn),并按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性優(yōu)化了hTFPI-2/KD3C的編碼基因的基礎(chǔ)上,將優(yōu)化的基因與畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K重組,用電轉(zhuǎn)化的方法使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤

5、酵母體內(nèi),篩選出高拷貝的轉(zhuǎn)化子。經(jīng)發(fā)酵、表達(dá)和純化后的目的蛋白純度達(dá)到97％,產(chǎn)量為25mg/L左右。
　　 在得到高純度的hTFPI-2/KD3C樣品后,本文首次在Bruker DMX500兆核磁共振儀上進(jìn)行了hTFPI-2/KD3C的1H NMR實(shí)驗(yàn),初步探討了其結(jié)構(gòu)和功能。利用hTFPI-1/KD3C與hTFPI-2/KD3C的高度同源性,我們從hTFPI-1/KD3C的已知結(jié)構(gòu)功能入手,探討了hTFPI-2/KD3C的結(jié)