脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景: 脂聯(lián)素(Adp)作為一種脂肪源性的細(xì)胞因子，具有改善胰島素敏感性、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。流行病學(xué)研究顯示脂聯(lián)素水平與胰島素抵抗及血栓性疾病發(fā)病呈負(fù)相關(guān)。脂聯(lián)素可以抑制單核細(xì)胞黏附分子及炎癥因子的表達(dá)、抑制巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，還可以增加內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮產(chǎn)生及減少氧自由基的產(chǎn)生。脂聯(lián)素可通過胰島素增敏、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗增殖和抗氧化等多重機(jī)制來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功

2、能。 由于血栓性疾病與凝血系統(tǒng)活性密切相關(guān)，而內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可以引起凝血活性異常。但是對(duì)于脂聯(lián)素對(duì)凝血系統(tǒng)活性有無影響，目前仍不清楚。組織因子(TF)是凝血系統(tǒng)啟動(dòng)的關(guān)鍵因子，TF介導(dǎo)的凝血激活在動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等血栓形成性疾病的發(fā)病中起了非常重要的作用。組織因子途徑抑制物(TFPI)是TF直接的生理性抑制物，在調(diào)節(jié)血栓形成過程中有重要作用。然而，脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用是否會(huì)影響在血栓形成過程中有重要作用的凝血因子TF

3、及TFPI的表達(dá)，國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。因此研究脂聯(lián)素對(duì)凝血活性的影響有著重要的意義，可以進(jìn)一步闡明血栓形成的部分機(jī)制，并能為防治血栓形成提供重要的理論依據(jù)。正是基于上述原因，本研究對(duì)脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TF及TFPI表達(dá)的影響及機(jī)制進(jìn)行探討。 本研究由以下三部分組成： 第一章 TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達(dá)的影響 目的：觀察在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)刺激下對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)

4、表達(dá)TF及TFPI的影響。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基；臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力；酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)定TF抗原和TFPI抗原的表達(dá)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)TF及TFPI基因的表達(dá)。 結(jié)果：各濃度的TNF-α對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力無明顯影響；TNF-α促進(jìn)TF抗原的表達(dá)，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，在TNF-α10 ng/ml作用6h時(shí)最明顯；TNF-α促進(jìn)TF

5、mRNA的表達(dá)，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，在TNF-α10ng/ml作用3h時(shí)已非常明顯，6h時(shí)達(dá)到高峰；TNF-α對(duì)HUVECs表達(dá)TFPI抗原及TFPI mRNA無明顯影響。 結(jié)論：TNF-α可以誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞表達(dá)TF；TNF-α對(duì)HUVNEC細(xì)胞TFPI的表達(dá)無明顯影響。 第二章脂聯(lián)素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達(dá)的影響 目的：觀察脂聯(lián)素對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞表達(dá)TF

6、和TFPI的影響。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI1640完全培養(yǎng)基；臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力；ELISA法測(cè)定TF抗原和TFPI抗原的表達(dá)；發(fā)色底物法測(cè)定TF及TFPI活性； RT-PCR檢測(cè)TF mRNA及TFPImRNA的表達(dá)。 結(jié)果：各濃度的脂聯(lián)素對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力無明顯影響；脂聯(lián)素可以在轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平上抑制由TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞TF的表達(dá)，同時(shí)TF活性水平也明顯減低；單純脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)

7、皮細(xì)胞表達(dá)TF表達(dá)無影響；脂聯(lián)素可以上調(diào)TFPI的抗原水平及活性水平，但脂聯(lián)素不影響TFPI mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)論：脂聯(lián)素可以在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞TF的表達(dá)；脂聯(lián)素上調(diào)TFPI抗原表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行的。 第三章脂聯(lián)素調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞組織因子和組織因子途徑抑制物表達(dá)的機(jī)制研究 目的：前文已經(jīng)報(bào)道脂聯(lián)素能抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs表達(dá)TF，并能在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)TFP

8、I的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)詳細(xì)探討脂聯(lián)素抑制TNF-α誘導(dǎo)的HUVECs表達(dá)TF及上調(diào)TFPI表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。 方法：HUVECs培養(yǎng)采用RPMI 1640完全培養(yǎng)基；臺(tái)盼藍(lán)染色法觀察細(xì)胞活力；ELISA法測(cè)定TF抗原和TFPI抗原的表達(dá)；發(fā)色底物法測(cè)定TF及TFPI活性；ELISA法檢測(cè)NF-κB結(jié)合活性；酶免疫分析(EIA)法檢測(cè)cAMP含量；PepTag法分析PKA活性水平；蛋白印跡法檢測(cè)p38MAPK、p44/42MAPK、S

9、APK/JNK、Akt、IκB-α的蛋白磷酸化水平。 結(jié)果：脂聯(lián)素使IκB-α磷酸化水平減少，但對(duì)p38MAPK、p44/42MAPK及SAPK/JNK的磷酸化水平無影響；脂聯(lián)素呈劑量依賴性的增加cAMP含量和PKA活性水平；脂聯(lián)素抑制TNF-α誘導(dǎo)的TF表達(dá)可以被PKA的特異性抑制劑Rp-cAMPs逆轉(zhuǎn)，并不影響脂聯(lián)素上調(diào)TFPI抗原的水平；脂聯(lián)素使Akt的磷酸化水平增加；脂聯(lián)素可明顯抑制TNF-a誘導(dǎo)的IkB-a的磷酸化水平

10、及NF-kB結(jié)合活性水平；PI3K的特異性抑制劑LY294002也能部分逆轉(zhuǎn)脂聯(lián)素對(duì)TF表達(dá)的抑制作用，預(yù)先聯(lián)合Rp-cAMPs和LY294002處理細(xì)胞能使脂聯(lián)素的抑制作用被逆轉(zhuǎn)約95％，脂聯(lián)素對(duì)TFPI抗原的上調(diào)作用不被這兩種抑制劑影響。 結(jié)論：PI3K-Akt和cAMP-PKA信號(hào)途徑的活化介導(dǎo)了脂聯(lián)素抑制TNF-a誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的作用；NF-kB信號(hào)途徑活性受抑在脂聯(lián)素抑制TNF-a誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF起了非常重