U937泡沫細(xì)胞中組織因子途徑抑制物2的表達(dá)及變化規(guī)律的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 動(dòng)脈粥樣硬化疾病已成為威脅國(guó)人健康的主要疾病之一,而動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)生與局部血栓形成密切相關(guān)[1]。組織因子(tissue factor,TF)是血栓形成的起始因子,組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)作為TF的生理抑制劑,它有兩種同族異形體,TTPI-1和TTPI-2。大量研究證實(shí)TFPI-1在抑制血栓形成和血管重塑

2、等方面發(fā)揮重要作用；TFPI-2與粥樣斑塊的穩(wěn)定性相關(guān),而它動(dòng)脈粥樣斑塊形成階段的作用尚無(wú)相關(guān)研究,我們前期動(dòng)物模型研究初步提示TFPI-2在其中具有一定作用[2]。單核細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞是粥樣斑塊早期形成階段的典型病變,貫穿AS疾病發(fā)生發(fā)展。我們希望以建立泡沫細(xì)胞模型為研究的切入點(diǎn),初步探討TFPI-2與AS斑塊形成之間的聯(lián)系。
　　 目的:
　　 1.研究TFPI-2蛋白在U937單核細(xì)胞和U937源性泡沫細(xì)胞的表達(dá)

3、定位；
　　 2.觀察氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)誘導(dǎo)U937源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中,TFPI-2蛋白表達(dá)和基因水平的變化規(guī)律；
　　 3.觀察外源性hrTFPI-2蛋白干預(yù),對(duì)U937源性泡沫細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇蓄積的影響,以確定TTPI-2與泡沫細(xì)胞形成是否存在聯(lián)系,并探討可能的機(jī)制和意義；
　　 4.觀察泡沫細(xì)胞形成中,影響TFPI-2表達(dá)的

4、因素。與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)共同培養(yǎng),U937源性泡沫細(xì)胞中TFPI-2蛋白表達(dá)和基因水平的變化規(guī)律,并探討該變化可能存在機(jī)制及意義。
　　 方法:
　　 1.采用改良沉淀法提取人血漿低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL),硫酸銅氧化制備ox-LDL,與U937單核細(xì)胞共同孵育,建立泡沫細(xì)胞模型。胞內(nèi)膽固

5、醇定量測(cè)定和油紅O染色定性評(píng)價(jià)建模成功。
　　 2.采用雙重細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)TFPI-2蛋白在泡沫細(xì)胞中的表達(dá)定位。
　　 3.在ox-LDL誘導(dǎo)U937源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中,分設(shè)觀察時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)半定量分析和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quant

6、itativePCR FQ-PCR)相對(duì)定量分析TFPI-2基因的動(dòng)態(tài)變化:采用時(shí)間免疫分辨熒光(time resolved fluorometric immunoassay,TRFIA)定量檢測(cè)TFPI-2蛋白表達(dá)水平。
　　 4.設(shè)rhTFPI-2不同濃度組(1nM,10nM,50nM,100nM,200nM),分別加入含ox-LDL終濃度為80μg/ml,細(xì)胞密度為15X104個(gè)/ml的U937細(xì)胞培液中,共同孵育48h后

7、提取細(xì)胞脂質(zhì),以脂質(zhì)測(cè)定試劑盒檢測(cè),計(jì)算胞內(nèi)膽固醇含量。
　　 5.將HUVEC和U937細(xì)胞共同培養(yǎng),分別用RT-PCR和TRFIA檢測(cè)TFPI-2基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　 6.用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示,組間比較采用成組t檢驗(yàn)分析；P<0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.泡沫細(xì)胞模型的建立和鑒定:
　　 1.1 ox-

8、LDL的制備和鑒定:
　　 分離冠心病患者血漿LDL,經(jīng)5％瓊脂糖電泳證實(shí)為單一條帶。由硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(thiobarbituric acid reactive substance,TBARS)值反映LDL氧化程度。新鮮LDL值為3.81±0.53 nM MDA/mg,而ox-LDL的值為31.95±2.93 nMMDA/mg,ox—LDL的TBARS值大于LDL的5倍以上,兩者相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),提示o

9、x-LDL脂質(zhì)被有效氧化。同時(shí)ox-LDL瓊脂糖電泳相對(duì)遷移率(relative electrophoresis mobility,REM)升高,亦證實(shí)ox-LDL制備成功。
　　 1.2 ox-LDL造模濃度確立和泡沫細(xì)胞模型鑒定:
　　 以細(xì)胞內(nèi)膽固醇定量和油紅染色定性,作為評(píng)價(jià)泡沫細(xì)胞的指標(biāo)。不同濃度組的ox-LDL與U937細(xì)胞共同孵育48h后,80mg/L ox-LDL組的胞內(nèi)膽固醇酯/總膽固醇(CE/TC)值

10、大于50％,光鏡下觀察油紅O染色,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒和脂質(zhì)空泡；80mg/L LDL組和60mg/L OX-LDL組的CE/TC值均低于50％；120mg/L ox-LDL組的CE/TC值雖大于50％,但凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多,不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；故選擇80mg/L ox-LDL與U937細(xì)胞(細(xì)胞密度15×104個(gè)/ml)共孵育48h,確定為最佳建模條件。
　　 2.TFPI-2蛋白在泡沫細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位:
　　 雙重細(xì)

11、胞免疫熒光證實(shí),TFPI-2蛋白主要定位于U937源性泡沫細(xì)胞胞漿,與TF蛋白有類似分布；與正常U937細(xì)胞相比較,泡沫細(xì)胞中TFPI-2蛋白和TF蛋白的分布情況更趨一致。HUVEC中也存在類似情況,且在氧化損傷情況下,細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的改變,熒光信號(hào)強(qiáng)度較正常情況下稍有減弱。
　　 3.泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中TFPI-2蛋白及基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化:
　　 TRFIA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),U937與ox-LDL孵育6h后,TFPI-2蛋白表

12、達(dá)量明顯增高達(dá)峰值；而在共同孵育6h至48h期間,TFPI-2蛋白表達(dá)量降低；孵育12h后,TFPI-2蛋白表達(dá)量基本低于正常水平。以看家基因β-action為內(nèi)參,FQ—PCR結(jié)果顯示,U937與ox-LDL孵育6h,TFPI-2 mRNA表達(dá)上調(diào)達(dá)至峰值；而6h至48h期間TFPI-2 mRNA表達(dá)下調(diào)。FQ-PCR結(jié)果與蛋白水平的變化相一致。
　　 4.外源性TFPI-2蛋白對(duì)泡沫細(xì)胞胞內(nèi)膽固醇的影響:
　　 分設(shè)

13、rhTFPI-2不同濃度組(1nM,10nM,50nM,100nM,200nM),加入含ox-LDL終濃度為80μg/ml的U937細(xì)胞培液中。比較各濃度組與空白組(0nM)之間數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):1nM組干預(yù)48h后TC和CE/TC水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(FC:24.733±1.504 VS23.130±2.341,P>0.1；TC::50.775±2.831 vs52.226±1.662,P>0.1),CE/TC為51.29％；在10nM,50

14、nM,100nM,200nM組干預(yù)48h后,各組FC值分別為21.041±1.702、20.911±2.012、20.790±1.127、20.552±2.733；各組TC值分別為38.707±2.011、34.956±2.562、32.118±1.920、32.168±3.023:各組CE/TC值分別為45.64％、40.18％、35.27％、36.11％,各組TC和CE/TC均明顯降低,與空白組(0nM)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0

15、.05)。外源性TFPI-2蛋白干預(yù)可減少泡沫細(xì)胞的胞內(nèi)膽固醇蓄積,該作用呈一定濃度依賴方式,TFPI-2與泡沫細(xì)胞形成存在關(guān)聯(lián)。
　　 5.內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)泡沫細(xì)胞形成中TFPI-2表達(dá)的影響:
　　 5.1 ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-2表達(dá)的影響:
　　 HUVEC與ox-LOL(80mg/L)共同孵育48h,其TFPI-2蛋白表達(dá)量呈先升高后降低的動(dòng)態(tài)改變；共同孵育24h后,其TFPI-2蛋白表達(dá)量達(dá)峰值。

16、RT-PCR結(jié)果顯示,在ox-LDL作用24h至48h期間,TFPI-2 mRNA的水平持續(xù)增高。提示氧化損傷可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞TFPI-2蛋白表達(dá)障礙。
　　 5.2內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中TFPI.2蛋白表達(dá)的影響:
　　 與單獨(dú)培養(yǎng)組比較,U937細(xì)胞與HUVEC共同培養(yǎng)時(shí)TFPI-2的蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)；隨著ox-LDL氧化損傷時(shí)間的延長(zhǎng),盡管共培養(yǎng)組U937細(xì)胞的TFPI-2蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì),但仍高于U93

17、7單獨(dú)培養(yǎng)組。RT-PCR結(jié)果顯示,U937細(xì)胞和HUVEC共同培養(yǎng)48h后,U937細(xì)胞TFPI-2 mRNA水平較單獨(dú)培養(yǎng)組明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.80 mg/L ox-LDL加入細(xì)胞密度為15×104個(gè)/ml的U937細(xì)胞培液中孵育48h,可成功建立U937源性泡沫細(xì)胞模型。
　　 2.TFPI-2蛋白主要定位于U937源性泡沫細(xì)胞胞漿中,與TF蛋白有相似分布。正常U937細(xì)胞中有同樣的分布規(guī)律

18、,但在泡沫細(xì)胞中TFPI-2蛋白和TF蛋白的分布更趨一致。
　　 3.U937源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中,早期TFPI-2蛋白和基因水平迅速上調(diào),而后期TFPI-2蛋白和基因水平明顯下調(diào),低于正常值水平。在泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中存在TPFI-2蛋白和基因水平的相對(duì)缺乏。
　　 4.外源性中高濃度的rhTFPI-2蛋白可改善U937源性泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中胞內(nèi)膽固醇蓄積,該效應(yīng)呈一定的濃度依賴方式；低濃度的rhTFPI-2蛋白無(wú)此效