microRNA-139在肝細胞肝癌患者中的表達及其臨床意義.pdf

1、肝細胞肝癌是常見的惡性腫瘤之一,全世界每年大概有64萬人被初次診斷患有HCC,其中半數(shù)以上是中國人。在中國,乙型肝炎病毒(HBV)感染導致肝硬化進而演變?yōu)镠CC是其發(fā)病率驟升的首要原因,據(jù)二十世紀90年代統(tǒng)計結(jié)果顯示,HCC已成為中國腫瘤相關(guān)致死率排名第二位的疾病。肝細胞肝癌病情進展極快,且具有發(fā)病隱匿的特點,多數(shù)患者由于在首次診斷HCC時即已出現(xiàn)了肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移,而喪失了接受根治性手術(shù)的機會;而另外一少部分患者,由于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷

2、并接受及時治療而獲得了較長的生存時間。因此,肝細胞肝癌患者的診斷是決定患者治療效果和生存的重要因素。至今為止,多種分子標志物用于HCC診斷,然而,它們均存在敏感度低、特異度不足的問題,因此尋找肝細胞肝癌靈敏度好、特異度高的腫瘤標志物是目前肝癌研究領(lǐng)域中迫切需要解決的問題。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類不參與編碼的小RNA分子,其在DNA完成轉(zhuǎn)錄之后的階段對靶基因表達進行調(diào)節(jié),與人體的生理活動和疾病發(fā)生過程緊密相關(guān),

3、特別是在腫瘤疾病中,miRNA可作為癌基因也可作為抑癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。MicroRNA在不同種類的腫瘤中具有明顯差異的表達模式,因此將其作為腫瘤診斷標志物或預(yù)后判斷指標是非常有希望的。
　　本課題希望通過芯片檢測、PCR檢測等方法尋找到一種能夠用于HCC診斷和判斷預(yù)后的分子標志物,主要包含以下四個部分:
　　第一部分:收集病例資料,選擇入組患者
　　方法:使用Epidata3.0建立數(shù)據(jù)庫,收集符合入組標準的

4、肝細胞肝癌患者及慢性乙型病毒性肝炎患者臨床病歷資料;使用SPSS21.0進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果:HCC患者血清AFP值為17.80ng/ml±598.60ng/ml,明顯高于CH組患者平均血清AFP值7.10ng/ml±13.10ng/ml,其間差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.007);此外,其它臨床信息差異無統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論:血清甲胎蛋白是臨床應(yīng)用最廣的肝細胞肝癌分子標志物之一,其在多數(shù)原發(fā)性HCC患者中明顯增高,但其

5、具敏感度低、特異度不足的缺陷。肝細胞肝癌患者和慢性乙型病毒性肝炎患者的一般臨床病歷資料相似,具有可比性。
　　第二部分:篩選肝細胞肝癌microRNA表達譜,選擇目標基因為microRNA-139
　　方法:應(yīng)用芯片技術(shù)篩選HCC的miRNA表達譜,經(jīng)分析數(shù)據(jù)和查閱文獻后選擇目標miRNA。
　　結(jié)果:芯片檢測結(jié)果顯示,HCC患者癌組織中表達量明顯降低的miRNA有:miRNA-139、miRNA-99a、miRNA-

6、27b、miRNA-378a、miRNA-378e及miRNA-30c,而明顯高表達的有:miRNA-21、miRNA-221、miRNA-148b以及miRNA-186。經(jīng)慎重的商討后,最終選擇microRNA-139為后續(xù)研究的主要對象。
　　結(jié)論:本課題芯片所獲得的肝細胞肝癌的miRNA表達譜與其它已發(fā)表文獻所報道的表達譜不盡一致,分析其原因可能是由于個體病例或個體樣本間的異質(zhì)性所致,提示我們腫瘤的發(fā)生過程是由數(shù)目繁多的基因

7、參與并調(diào)控,具有相當?shù)膹?fù)雜性和多樣性。MicroRNA-139在多種惡性腫瘤中下調(diào)表達,而在肝細胞肝癌臨床研究方面尚無報道,選其為后續(xù)研究的目標基因符合本課題研究目的,具有可行性。
　　第三部分:RT-qPCR檢測多個組織及血漿標本中microRNA-139表達量
　　方法:miRNeasy Mini試劑盒提取組織標本中總RNA,BLOODmisi試劑盒提取血漿標本中總RNA,經(jīng)分光光度計檢測總RNA溶液純度達標準后,使用R

8、T-qPCR方法檢測每個樣本中miRNA-139的表達量。
　　結(jié)果:相比于癌旁標本,miRNA-139在癌標本中表達明顯下調(diào);相比于CH患者的血漿標本,microRNA-139在HCC患者血漿中表達亦下調(diào);相關(guān)分析提示,miRNA-139在肝細胞肝癌患者癌標本中與血漿標本中的表達水平具有正相關(guān)性。
　　結(jié)論:microRNA-139在肝細胞肝癌中下調(diào)表達,同時有文獻報道其在其它多種癌癥中亦有同樣的表現(xiàn),因此我們認為miRN

9、A-139下調(diào)表達是存在于惡性腫瘤中的普遍現(xiàn)象。本部分實驗還發(fā)現(xiàn)組織和血漿中miRNA-139表達量存在正相關(guān)性,出現(xiàn)該結(jié)果的原因眾說紛紜,但目前主流的觀點認為,循環(huán)血液中的miRNA是由腫瘤相關(guān)微泡或外泌體釋放而來的,同時,也正是由于微泡或外泌體的保護,使循環(huán)血液中的miRNA免受RNase的降解。
　　第四部分:肝細胞肝癌患者血漿中microRNA-139的臨床意義
　　方法:基于31名HCC患者的臨床病歷資料及其血漿m

10、iRNA-139的表達量數(shù)據(jù),使用軟件SPSS21.0統(tǒng)計分析miRNA-139的臨床意義,當相對應(yīng)的p值小于0.05時認為差異存在統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:血漿microRNA-139可作為診斷HCC的分子標志物,尤其是當其與血清AFP聯(lián)合應(yīng)用時,敏感度可達90.3％、特異度可達87.1%。根據(jù)31名HCC患者血漿microRNA-139表達量高低,將≤-3.240的25名HCC患者歸為低表達組,將>-3.240的6名患者分為高表

11、達組。統(tǒng)計結(jié)果提示:血漿miRNA-139表達水平與HCC患者的病理E-S分級、血清AFP值、CEA值及直接膽紅素具有相關(guān)性。此外,短期生存分析提示,miRNA-139低表達組患者1年生存率為48.0%、中位生存時間為439天±50天,高表達組患者1年生存率為66.7%、中位生存時間為503天±69天,通過校正患者病理E-S分級、Child-Pugh分級、CLIP評分等因素后,發(fā)現(xiàn)miRNA-139高、低表達組中患者1年生存率差異具有統(tǒng)

12、計學意義。
　　結(jié)論:miRNA-139單獨診斷HCC具有較高的敏感度,達到80%以上,但特異度相對較低,因此,我們將miRNA-139與AFP聯(lián)合應(yīng)用,使其敏感度和特異度均得到明顯提升。此外,我們發(fā)現(xiàn)miRNA-139表達水平與病理E-S分級呈負相關(guān)性,即miRNA-139表達水平越低,E-S分級的級別越高,而病理E-S分級隨著腫瘤侵襲性的增強而升高,這也說明miRNA-139在肝細胞肝癌中扮演著保護性因素的角色。最后的短期生存