氧化脂蛋白(a)對(duì)HUVECs的DSG1和DSC2表達(dá)及單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響.pdf

1、研究背景:動(dòng)脈粥樣硬化(As)是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程,目前認(rèn)為其發(fā)病主要與血漿中脂蛋白水平升高,動(dòng)脈內(nèi)膜損傷導(dǎo)致動(dòng)脈壁通透性增加以及脂蛋白穿過單層內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)膜下沉積有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn),氧化脂蛋白(a)(oxLp(a))在As斑塊中廣泛存在,其中破裂斑塊尤其突出,并且與泡沫細(xì)胞共存,這提示了oxLp(a)與As的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血管內(nèi)皮在維持血管的正常形態(tài)和功能中起重要作用,血管內(nèi)皮是由單層內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接而成,因此細(xì)胞與細(xì)胞之間的

2、連接至關(guān)重要,而橋粒連接是最主要的血管內(nèi)皮的連接方式。橋粒芯糖蛋白-1(DSG1)和橋粒芯膠蛋白-2(DSC2)屬于橋粒鈣粘素蛋白家族成員,參與了血管壁生理屏障的構(gòu)成,維持細(xì)胞與細(xì)胞之間的完整性,因此細(xì)胞與細(xì)胞之間的這種橋粒連接在調(diào)控單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性上起著非常重要的作用。本研究旨在探討oxLp(a)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DSG1和DSC2表達(dá)的影響,以及由此導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變,以及活性氧(ROS)在其中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一

3、:oxLp(a)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DSG1,DSC2表達(dá)的影響
　　目的:觀察oxLp(a)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上跨膜蛋白DSG1和DSC2表達(dá)的影響。
　　方法:待細(xì)胞生長融合后,每次實(shí)驗(yàn)前6h給HUVECs換上新鮮的無血清培養(yǎng)基以獲得同步化生長,6h后再換上新鮮的培養(yǎng)基并加入不同濃度的oxLp(a)(0mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L)處理HUVECs24h,檢測(cè)不同濃度的oxLp(a)對(duì)HUVE

4、Cs上DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白表達(dá)的影響;再用100 mg/L oxLp(a)分別處理HUVECs不同時(shí)間(0h,6h,12h,24h),用RT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:oxLp(a)濃度依賴性地下調(diào)HUVECs上DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá),oxLp(a)在25 mg/L時(shí)即有顯著作用(P<0.05),且隨著oxLp(a)濃

5、度的升高,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈濃度依賴的下降趨勢(shì),100 mg/L組與0mg/L相比,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)最明顯(P<0.05);100 mg/L oxLp(a)在孵育6h即能顯著下調(diào)DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)(P<0.05),且隨著處理時(shí)間的延長,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白表達(dá)水平呈時(shí)間依賴的下降趨勢(shì),24h組與0h組比較,DSG1、DSC2 mRNA和蛋白的表達(dá)

6、下調(diào)最明顯(P<0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二:ROS參與oxLp(a)對(duì)HUVECs DSG1,DSC2表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　目的:觀察oxLp(a)是否通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成來調(diào)節(jié)HUVECs上DSG1,DSC2的表達(dá)。
　　方法:用100 mg/L Lp(a)、100 mg/L oxLp(a)、100 mg/L BSA、200μmol/L H2O2分別與HUVECs孵育24h,空白組作為對(duì)照,用RT-PCR和Wester

7、n blotting分別檢測(cè)DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)情況。用100 mg/L oxLp(a)、100 mg/LSOD預(yù)孵育1h后再加入100 mg/L oxLp(a)、100 mg/LSOD分別處理 HUVECs24h,空白組作為對(duì)照,用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成情況;用RT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:oxLp(a)、

8、H2O2顯著下調(diào)HUVECs DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)(P<0.05),而Lp(a)、BSA對(duì)其無明顯影響(P>0.05)。oxLp(a)組與空白對(duì)照組相比,細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成明顯增多,用SOD預(yù)孵育后,活性氧的產(chǎn)生有所降低,而SOD組與對(duì)照組相比無明顯差別;oxLp(a)抑制DSG1,DSC2 mRNA以及蛋白的表達(dá)(P<0.05),而用SOD預(yù)孵育后,這種抑制作用得到了改善,SOD組與對(duì)照組相比無明顯差別,這與活性

9、氧的測(cè)定結(jié)果是相一致的。
　　實(shí)驗(yàn)三:oxLp(a)對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響
　　目的:觀察oxLp(a)對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。
　　方法:用100 mg/L oxLp(a)處理HUVECs24h后,在上室加入FITC-dextran,分別在不同的時(shí)間點(diǎn)(0h,0.25h,0.5h,1h,2h,4h)收集下室中的液體,測(cè)量液體的熒光強(qiáng)度,確定測(cè)量通透性的最佳時(shí)間。用不同濃度的oxLp(a)(0mg/L,25 m

10、g/L,50 mg/L,100 mg/L)分別或者與SOD共同孵育HUVECs24h后,在上室中加入FITC-dextran與孵育2h,空白組作為對(duì)照,取下室中的液體用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度,代表通透性改變。
　　結(jié)果:oxLp(a)處理細(xì)胞24h后,在上室中加入 FITC-dextran,不同時(shí)間點(diǎn)收集下室中的液體測(cè)量熒光強(qiáng)度,結(jié)果顯示,在2h時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng),4h與2h相比無顯著差異(P>0.05),說明2h是測(cè)量通透性的最

11、佳時(shí)間;oxLp(a)也以劑量依賴性的方式增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性,在25 mg/L時(shí)即有作用(P<0.05),隨著oxLp(a)濃度的升高,單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性也逐漸增加,100 mg/L時(shí)作用最明顯(P<0.05);100 mg/L oxLp(a)所致的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加能夠被SOD所抑制(P<0.05)。
　　結(jié)論:oxLp(a)以劑量和時(shí)間依賴性方式下調(diào) HUVECs上 DSG1,DSC2的表達(dá),并增加單層內(nèi)皮細(xì)胞的