血管生成素樣蛋白3調(diào)節(jié)人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的研究.pdf

1、目前，越來(lái)越多的研究證實(shí)腎小球足細(xì)胞分泌的一些分子能影響腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞濾過(guò)功能的改變而參與蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素1(angiopoietin1，Ang1)。本課題組曾應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)微小病變腎病綜合征患兒的血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein3，Angptl

2、3)mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常兒童，及應(yīng)用激光微切割技術(shù)分離腎組織發(fā)現(xiàn)在阿霉素大鼠腎病模型的腎小球內(nèi)Angptl3 mRNA和蛋白的表達(dá)隨著蛋白尿的加重而表達(dá)增高，并運(yùn)用Western免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞表達(dá)Angptl3，進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)在微小病變和膜性腎病腎小球內(nèi)Angptl3顯著高于正常對(duì)照、薄基底膜腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Angptl3在腎小球內(nèi)由足細(xì)胞分泌，并可能參與了蛋白尿

3、的發(fā)生和發(fā)展。
　　 血管生成素樣蛋白是與血管生成素結(jié)構(gòu)相似的糖蛋白，其含有N端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和C段的纖維蛋白原同源區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)Angptl3能與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞整合素αvβ3纖維蛋白原同源區(qū)域結(jié)合，而其它研究已發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3也是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cells，GEnCs)表達(dá)的整合素異構(gòu)體之一。因此，我們推測(cè)在腎小球由足細(xì)胞分泌Angptl3可能通過(guò)與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素αvβ

4、3結(jié)合調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性參與了蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展。為此我們進(jìn)行了以下三部分的研究，以探討Angptl3是否能調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的通透性并研究其作用的可能機(jī)制。
　　 第一部分腎小球內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)和單層膜的建立
　　 目的：觀察腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在微孔細(xì)胞培養(yǎng)嵌套的濾膜上是否能形成生成致密連接的單層膜。
　　 方法：以3-8代的GEnCs密度為1×105/cm2接種于微孔細(xì)胞嵌套濾膜上。對(duì)濾膜腎小球內(nèi)皮細(xì)胞行考馬

5、斯亮蘭染色和定期測(cè)定濾膜腎小球內(nèi)皮細(xì)胞電阻以確定GEnCs是否形成致密連接的單層膜。
　　 結(jié)果：考馬斯亮蘭染色見(jiàn)GEnCs單層膜呈現(xiàn)為藍(lán)色的片狀，細(xì)胞間無(wú)間隙，表明GEnCs匯合成致密的單層。形成致密融合狀態(tài)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞單層膜電阻為(30.45±1.52)Ω/cm2。
　　 結(jié)論：在微孔細(xì)胞嵌套濾膜上生長(zhǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞能形成致密的單層膜。
　　 第二部分血管生成素樣蛋白3調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性
　

6、　 目的：探討血管生成素樣蛋白3對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。方法：腎小球內(nèi)皮細(xì)胞接種于微孔細(xì)胞培養(yǎng)嵌套的濾膜上，待細(xì)胞形成致密的單層膜后，分別給予不同濃度的Angptl3(0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.51μg/ml)作用1h；用濃度為0.5μg/ml Angptl3分別作用于GEnCs1h、2h、3h。采用Millicell-ERS和兩室彌散系統(tǒng)分別檢測(cè)跨GEnCs單層膜電阻(TEER)和跨GEnCs

7、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的白蛋白(FITC-BSA)濾過(guò)率。
　　 結(jié)果：Angptl3可顯著增加GEnCs的通透性，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。(1)Angptl3濃度達(dá)到0.1μg/ml始明顯降低TEER和增加GEnCs對(duì)FITC-BSA的濾過(guò)率，分別為TEER降低33.2％(20.32Ω/cm2±4.52Ω/cm2 vs30.42Ω/cm2±1.45Ω/cm2)、FITC-BSA濾過(guò)率增加42.5％(0.17±0.045 v

8、s0.12±0.019)(與對(duì)照組比較，P<0.01)，Angptl3濃度達(dá)到0.5μg/ml時(shí)，其對(duì)GEnCs的作用達(dá)到飽和；(2)0.5μg/ml Angptl3作用GEnCs1h、2h、3h可使TEER分別降低46.9％(16.19Ω/cm2±3.26Ω/cm2 vs30.61Ω/cm2±5.65Ω/cm2)、19.5％(24.81Ω/cm2±2.53Ω/cm2 vs30.82±5.72Ω/cm2)、16.0％(25.76Ω/cm

9、2±2.12Ω./cm2 vs30.6±5.76Ω/cm2)，可使FITC-BSA濾過(guò)率分別增加63.6％(0.20±0.032 vs0.12±0.027)、59.7％(0.1±0.056 vs0.16±0.045)、50.9％(0.30±0.089 vs0.2±0.072)(與對(duì)照組比較，P<0.01)。
　　 結(jié)論：血管生成素樣蛋白3能導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加，引起跨腎小球內(nèi)皮細(xì)胞單層膜電阻下降和對(duì)FITC-BSA濾過(guò)

10、率增加。
　　 第三部分血管生成素樣蛋白3調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性機(jī)制的研究
　　 目的：探討血管生成素樣蛋白3調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)通路。
　　 方法：(1)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)血清饑餓1小時(shí)，再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)或PBS作用1、2、3、4、5、6小時(shí)，Western blot檢測(cè)不同處理時(shí)間點(diǎn)磷酸化Akt、總Akt、磷酸化FAK、總FAK、磷酸化ERK、總ERK的表達(dá)水平；(2)PI3K

11、/Akt信號(hào)通路PI3K特異性抑制劑-LY294002(1μM)或MAPK信號(hào)通路的MEK特異性抑制劑-PD89095(1μM)預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共作用1小時(shí)，測(cè)定腎小球內(nèi)皮細(xì)胞單層膜電阻和對(duì)FITC-BSA的濾過(guò)率；(3)整合素αvβ3單克隆抑制劑-LM609(1μM)預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1、3、5小時(shí)，Western bl

12、ot檢測(cè)磷酸化Akt和總Akt的表達(dá)水平；(4)LM609(1μM)預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1小時(shí)，測(cè)定腎小球內(nèi)皮細(xì)胞單層膜電阻和對(duì)FITC-BSA的濾過(guò)率。
　　 結(jié)果：(1)Angptl3處理后腎小球內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Akt和磷酸化FAK的表達(dá)水平顯著增高(與對(duì)照組相比，P<0.01)，磷酸化的ERK無(wú)明顯變化(與對(duì)照組比較，P>0.051；(2)PI3K信號(hào)通路抑制劑LY2

13、94002預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)能顯著抑制Angptl3誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增高，能使Angptl3引起的跨腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的TEER下降減少約71％和對(duì)FITC-BSA濾過(guò)率的增加下降約76％(與血管生成素樣蛋白3處理組比較，P<0.01)，而MAPK信號(hào)通路抑制劑PD98059對(duì)Angptl3誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的TEER的下降和對(duì)FITC-BSA濾過(guò)率的增加沒(méi)有顯著抑制作用(與血管生成素樣蛋白3處理組比較，P>0.05)

14、；(3)LM609(1μM)預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，能顯著抑制Angptl3誘導(dǎo)的磷酸化Akt的增高(與血管生成素樣蛋白3處理組比較，P<0.01)；(4)LM609(1μM)預(yù)處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞1小時(shí)，能顯著抑制Angptl3誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增高，能使Angptl3引起的跨GEnCs的TEER下降減少約74％和對(duì)FITC-BSA濾過(guò)率增加下降約77％(與血管生成素樣蛋白3處理組比較，P<0.01)。
　　 結(jié)論