陸地棉抗除草劑基因的遺傳轉(zhuǎn)化及其抗鎘脅迫的遺傳效應(yīng)探討.pdf

1、棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉花遺傳改良可以通過(guò)傳統(tǒng)的育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)代生物技術(shù)通過(guò)DNA重組技術(shù)將外源性狀轉(zhuǎn)入到寄主基因組，可實(shí)驗(yàn)基因在不同生物界之間的自由交換和流動(dòng)，對(duì)于增加作物產(chǎn)量、提高產(chǎn)品質(zhì)量、減少生產(chǎn)成本和環(huán)境脅迫均具有重要的作用。本研究通過(guò)比較二種非基因型限制的外源基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，將抗除草劑基因(Bar和Cyp81A6)導(dǎo)入到陸地棉，獲得轉(zhuǎn)基因植株，并育成抗除草劑的轉(zhuǎn)基因陸地棉種質(zhì)系(BR001)。同時(shí)研究了抗

2、除草劑轉(zhuǎn)基因種質(zhì)系的生產(chǎn)性能、纖維品質(zhì)、抗性遺傳等，并以抗蟲轉(zhuǎn)基因抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種(GK30)和它的遺傳背景親本為對(duì)照，研究了轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系(BR001)在鎘脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育和組織生理反應(yīng)。主要結(jié)果如下： 1.本研究探討了兩種非基因型依賴性的遺傳轉(zhuǎn)化方法，并研究了Bar基因在轉(zhuǎn)基因后代的分離和遺傳特點(diǎn)，以及抗除草劑棉花種質(zhì)系(BR001)的生產(chǎn)性能和纖維品質(zhì)。PCR和Southern雜交分析表明，外源基因已成功地插入到兩

3、種方法獲得的轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。盡管項(xiàng)尖農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法的轉(zhuǎn)化效率高于花粉管通道法，但獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量無(wú)明顯差異。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花種質(zhì)系(BR001)的農(nóng)藝性狀略差于親本，但纖維品質(zhì)略優(yōu)于對(duì)照。本試驗(yàn)結(jié)果表明兩種方法均可用于棉花外源基因的轉(zhuǎn)化。 2.本研究用珂字棉312和珂字棉201胚性愈傷組織為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將來(lái)源于水稻抗苯拉松除草劑基因(Cyp81A6)導(dǎo)入棉花基因組。將以VaMV35啟

4、動(dòng)子、Cyp81A6基因、NPII基因構(gòu)建于質(zhì)粒并導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌系LBA444，與胚性愈傷組織共培養(yǎng)48h后脫菌，接到含100mg/L卡那霉素和卡那霉素+苯拉松的篩選培養(yǎng)基上篩選3次，并在非篩選培養(yǎng)基上繼代2～3次后獲得大量的體細(xì)胞胚狀體，并獲得再生小植株?？敲顾睾捅嚼设b定，以及PCR分析結(jié)果均表明，外源抗草劑基因已成功地導(dǎo)入兩個(gè)基因型的基因組中。目前，轉(zhuǎn)基因植株已移至溫室。 3.本文研究了不同濃度的鎘對(duì)抗除草劑轉(zhuǎn)基因陸地棉

5、種質(zhì)系(BR001)及其抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種(GK30)和它的親本Coker312在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上的影響。結(jié)果表明低濃度(10μM、100μM)的鎘對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因栽培品種的發(fā)芽起到了促進(jìn)作用，但是高濃度的鎘(1000μM)對(duì)發(fā)芽起到的是抑制作用。在Coker312的發(fā)芽實(shí)驗(yàn)中，鎘的毒害作用是很強(qiáng)烈的，無(wú)論是低濃度的還是高濃度的對(duì)Coker312的發(fā)芽起到的都是副作用。本文還探討了不同濃度的鎘對(duì)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種的全植株和根的生理和形態(tài)產(chǎn)生的不同影

6、響。幼苗根鎘的積累率比莖高。在本實(shí)驗(yàn)中GK30的鎘積累率是最高的，隨后是BRO01，最少的是珂字312。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種和珂字312的根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化主要取決于鎘的濃度。隨著鎘濃度的增加它們的根的微細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)隨之發(fā)生變化。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品種表現(xiàn)出了原生質(zhì)體分離，液泡和細(xì)胞核增大的現(xiàn)象。但是珂字312除了液泡增大、線粒體增多外，根尖的亞顯微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。在參試的三個(gè)材料的液泡和細(xì)胞壁上可以看到鎘顆粒的堆積。這些結(jié)果顯示鎘對(duì)棉花幼苗期毒害作

7、用是比較大的。BRO01對(duì)鎘敏感，GK30和珂字312對(duì)鎘具有一定的抗性。 4.鎘對(duì)抗除草劑轉(zhuǎn)基因陸地棉種質(zhì)系(BRO01)及其抗蟲轉(zhuǎn)基因推廣品種(GK30)和它的親本Coker312植株在形態(tài)和生理上影響的研究結(jié)果表明，在0，10，100，1000μM鎘濃度下，根、葉片、莖、葉片的厚度和它們的鮮重、干重都呈直線下降趨勢(shì)。鎘對(duì)根、莖、葉的吸水性有一定的刺激作用，其中對(duì)葉片的作用最高，其次是根和莖。在本實(shí)驗(yàn)中鎘在BR001的富集率

8、是最高，其次是GK30珂字312。根和莖對(duì)鎘的吸收是相互關(guān)聯(lián)的，它們的鎘的吸收量影響了根、莖、葉的吸水能力。隨著鎘的濃度的提高葉肉細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，BR001表現(xiàn)最明，顯其次是GK30和珂字312。鎘對(duì)光合器官也存在一定影響，在本實(shí)驗(yàn)中葉綠體和線粒體的大小和數(shù)量都發(fā)生了變化。三個(gè)參試材料的液泡和細(xì)胞壁中可以清楚的看到鎘粒子。液泡膜沒(méi)有發(fā)生變化。這表明這些鎘的濃度沒(méi)有影響到水分的吸收，還說(shuō)明了這些材料對(duì)鎘有不同的耐性。 5

9、.本文研究了增加鎘濃度對(duì)轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種及其野生型棉花鎘誘導(dǎo)氧化代謝的作用。研究結(jié)果表明，不同濃度的鎘處理顯著地影響了抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。鎘脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉品種和轉(zhuǎn)基因抗除草劑種質(zhì)系及其野生型之間的酶活水平?jīng)]有顯著的差異。與其它器官相比，鎘更能誘導(dǎo)葉片的酶活水平。此外，參試材料的抗氧酶活與耐鎘性之間沒(méi)有直接關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)的材料中這些酶的不同表型表明它們?cè)诩?xì)胞和分子水平上可能對(duì)不同的耐性機(jī)制，并需要進(jìn)行驗(yàn)證