陸地棉抗枯萎病基因的RGAP分子標(biāo)記研究.pdf

1、棉花是我國人民衣著、紡織工業(yè)的主要原料和出口創(chuàng)匯的重要產(chǎn)品，關(guān)系國計(jì)民生，意義重大?？菸∈敲藁▋煞N重要病害之一，是一種世界性棉花病害。在我國也有發(fā)生并導(dǎo)致棉花的嚴(yán)重減產(chǎn)。由于棉花基因組本身具有的復(fù)雜性及該病抗病遺傳規(guī)律的復(fù)雜性，所以一直無法克隆到抗病基因，近年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是分子標(biāo)記技術(shù)的日趨完善。越來越多的科學(xué)家希望利用這些方法來鑒定和分離抗病基因，揭示棉花品種的遺傳多樣性以及發(fā)展新的棉花育種方法。尋找與抗性位點(diǎn)緊

2、密連鎖的標(biāo)記以及分子輔助育種的建立都將加速棉花的抗病育種進(jìn)程。 目前，不少植物抗病基因被標(biāo)記定位甚至克隆，在被克隆的已知功能的R基因中存在有特征性的保守結(jié)構(gòu)域，如核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide-bindingsite，NBS)、富含亮氨酸重復(fù)(1eucine-richrepeats，LRR)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶類似受體(receptor-likeserine/threoninekinases，STK)，以及與果蠅To

3、ll蛋白及哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體(tollandinterleukin-receptor，TIR)的胞外域相似的區(qū)域。這些氨基酸水平上的保守結(jié)構(gòu)域可能與基因的功能有關(guān)。根據(jù)已克隆基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并或特異引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增植物基因組DNA或cDNA，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序和序列對(duì)比即可作為抗病基因類似物(resistancegeneanalog，RGA)。與已克隆抗病基因同源性較高的RGAs可作為探針，篩選抗感分離群體，進(jìn)行抗病

4、基因的分子標(biāo)記定位，此技術(shù)即為RGAP(resistancegeneanalogpolymorphism)標(biāo)記。 本研究首先從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和其他一些數(shù)據(jù)庫中獲取部分已克隆的植物抗病基因的核苷酸序列以及117條棉花的抗病基因同源序列的核苷酸序列。獲取其登錄號(hào)及編碼的氨基酸序列。對(duì)提供的氨基酸序列利用BLASTp進(jìn)行分析，尋找其保守區(qū)域。對(duì)NBS類型的RGAs編碼的氨基酸序列利用

5、DNAman進(jìn)行多重對(duì)比分析，并利用NCBI中的BLASTp程序與已克隆的植物抗病基因進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示：1.棉花基因組中也存在大量的抗病基因同源序列，其NBS保守區(qū)P-loop結(jié)構(gòu)大多為：GGGVGKTT。Kinase-2結(jié)構(gòu)大多為：LLVLDDV?？缒^(qū)也表現(xiàn)出較強(qiáng)的保守性，氨基酸序列大都為GLPLAL。2.在棉花基因組中存在兩種類型的抗病基因，符合在雙子葉植物中同時(shí)含有TIR-NBS和non-TIR-NBS兩種類型的抗病基因

6、。3.已克隆的棉花抗病基因同源序列與已克隆的植物抗病基因具有較大的同源性，證實(shí)了利用RGA進(jìn)行抗病基因克隆的可行性。本研究采用RGAP分子標(biāo)記技術(shù)，通過對(duì)抗病品種中12與感病品種軍棉一號(hào)的抗感雜交分離世代F2群體進(jìn)行DNA多態(tài)性分析，共篩選了11對(duì)引物組合，其中F3-R3引物對(duì)可在中12抗病親本和F2代抗病群體中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出一條大小在400bp的DNA多態(tài)性片段，在感病親本中沒有擴(kuò)增到。對(duì)特異條帶進(jìn)行了回收克隆測序，測出條帶的長度為39

7、6bp。生物信息學(xué)分析顯示，該片斷中與Genbank上的抗病基因同源序列具有同源性，用DNAMAN軟件翻譯后，得到的氨基酸序列含有抗病基因跨膜保守區(qū)域GLPL以及NBS結(jié)構(gòu)。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，其中S3-AS3對(duì)F2群體進(jìn)行檢測時(shí)，可擴(kuò)增一條200bp大小的條帶并與抗病位點(diǎn)連鎖，可以作為棉花抗枯萎病基因的有效的分子標(biāo)記。 本文還對(duì)陸地棉抗枯萎病遺傳規(guī)律、RGAP標(biāo)記技術(shù)的可靠性及注意事項(xiàng)進(jìn)行了探討，同時(shí)對(duì)RGAP標(biāo)記