檢測HBV YMDD突變生物傳感器基因芯片的制備及其初步臨床應用.pdf

1、建立一種無需大型設備，基因芯片信號經(jīng)生物傳感器原位放大后可肉眼判讀的乙型肝炎病毒YMDD突變檢測的生物傳感器基因芯片，使之成為一種成本低、耗時短、能在基層醫(yī)院普及應用的YMDD突變檢測基因芯片。 方法: (1)在我們生物傳感器基因芯片技術專利和前期研究的基礎上，應用clustal軟件，通過對Genebank中200個以上乙型肝炎病毒的全基因組序列，進行比對分析，找到保守序列及突變特異性序列。根據(jù)乙型肝炎病毒YMDD區(qū)特異

2、性的基因序列，設計合成檢測YMDD區(qū)rtL180M,rtM2041,rtM204V等突變位點的成套探針，應用我們的專利技術，將其固定在功能化薄膜生物傳感器基片上，制備出相應的YMDD突變檢測基因芯片。 (2)應用人工合成的特異性YMDD寡核苷酸、經(jīng)測序證實的YMDD突變質(zhì)粒及本實驗室保存的經(jīng)基因芯片檢測并測序確定突變類型的13份臨床血清作為陽性標準品，根據(jù)不同探針與目的片段雜交的Tm值差異，在特定離子濃度條件下進行洗脫，最終獲得

3、特異性的突變型或野生型毒株的鑒別信號，以建立相應的檢測方法并驗證其特異性。 (3)通過使用梯度稀釋的含YMDD序列的單鏈寡核苷酸、YMDD質(zhì)粒及不同病毒載量的HBV血清為模板的PCR產(chǎn)物，探索本芯片系統(tǒng)檢測的敏感性。 (4)通過同一樣本的重復檢測，以驗證本款生物傳感器基因芯片的可重復性。 (5)最后，在此基礎上，應用該芯片系統(tǒng)對不同類型的臨床血清進行檢測，進一步驗證本芯片系統(tǒng)的臨床使用可靠性。 結(jié)果:

4、 本研究結(jié)果表明，在我們以往研究的生物傳感器基因芯片的基礎上，本款YMDD突變檢測生物傳感器芯片較好地實現(xiàn)了YMDD突變信號的檢測，達到了不需要任何大型設備，就可準確判讀檢測結(jié)果的水平。此外，本研究還表明： (1)本實驗的PCR擴增體系，穩(wěn)定可靠，擴增效率較高，其最低檢測模板病毒載量濃度為103copies/ml，具有較高的擴增靈敏度； (2)在病毒載量濃度為103copies／ml濃度及單鏈寡核苷酸濃度為0.01

5、um的濃度下，可實現(xiàn)穩(wěn)定的可重復性的雜交信號，證明本芯片具有較高的檢測靈敏度。 (3)該生物傳感器基因芯片系統(tǒng)對人工合成的6種寡核苷酸、2種YMDD突變質(zhì)粒及本實驗室保存的經(jīng)基因芯片檢測并測序確定突變類型的13份臨床血清進行檢測，檢測結(jié)果與其測序結(jié)果完全一致，提示本芯片對相應位點的檢測具有很高的特異性，重復性好。 (4)110例拉米夫定治療半年以上的臨床血清中，經(jīng)檢測，野生型80例，YIDD變異型11例，YVDD變異型1

6、6例，YIDD、YVDD混合突變型3例。50例未經(jīng)核苷類抗病毒治療的HBV DNA陽性血清中，檢測到1例YVDD突變型。50例正常人血清未檢測到探針陽性信號，具有較高的臨床可靠性。 本芯片集生物傳感器技術、基因芯片技術及生物素標記技術為一體，通過生物傳感器將基因芯片檢測信號原位放大，從技術上實現(xiàn)了不需要大型設備、肉眼即可判讀，大大降低了臨床使用的成本。本款以檢測YMDD突變?yōu)橹饕康牡男酒瑹o需任何大型設備，解決了基因芯片技術在基