水稻熱激蛋白Hsp90基因的克隆及互作蛋白的篩選.pdf

1、逆境脅迫(如低溫、高溫、干旱、高鹽等)會引起植物體內發(fā)生一系列的生理反應，表現(xiàn)為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引起不可逆?zhèn)?，導致整個植株死亡。在逆境條件下，植物可以利用體內的一些已有蛋白或新合成的一些蛋白，來維持正常條件下才能進行的一些新陳代謝。由于這些蛋白對植物度過逆境具有非常重要作用，因此通稱為植物逆境蛋白，是當今分子生物學、蛋白質組學和植物抗逆生理的一個重要研究內容，其中心問題是逆境蛋白的生物學功能。近年來，隨著分子生物學理

2、論和技術的滲透，逆境蛋白的研究有了很大進展，一些編碼逆境蛋白的基因已被分離。全面深入地認識逆境蛋白的生理機理，準確掌握逆境蛋白在植物體內的理化性質及生物學功能，將有助于了解植物對逆境的適應機制，對植物抗逆品種的篩選和培育等具有指導意義。 熱激蛋白(HeatShockProtein，Hsp)是一類在逆境脅迫特別是高溫脅迫誘導下，生物體內生成的高度保守的逆境蛋白家族，是目前發(fā)現(xiàn)的主要分子伴侶蛋白之一，直接參與并促進細胞內蛋白質從初生

3、鏈的合成到多亞基復合體折疊、裝配等整個生物過程。目前，Hsp在動物中研究居多，而植物中研究較少。本研究主要以水稻熱激蛋白Hsp90作為研究對象，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選其互作蛋白，為進一步研究OsHsp90的功能，尤其是作為分子伴侶的作用機制打下基礎。主要研究結果如下： 1、采用熒光差異顯示(FluorescentDifferemialDisplay，F(xiàn)DD)技術，比較分析了高溫處理與未處理的水稻根、葉鞘和葉中的mRNA表達，并利

4、用HA.Yellow-PAGE(含0.1％HA.Yellow)再分離與大矩陣篩選相結合的方法，發(fā)現(xiàn)一個水稻熱激蛋白Hsp90差異片段。經(jīng)RACE-PCR克隆其cDNA全長，擁有2408bp堿基，編碼一個具有699AA殘基的多肽，其中，第26-35AA殘基是Hsp90家族的保守序列，第28-182AA殘基是一個ATPase結構域，第185-699AA殘基是Hsp90結構域，命名為OsHsp90(GenBank登錄號為AB111810)。

5、 2、利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選OsHsp90的互作蛋白，特別是篩選結合位點位于ATPase結構域之外區(qū)域的互作蛋白。經(jīng)嚴格篩選，共得到13個陽性菌落。其中結合位點位于ATPase結構域之后區(qū)域的有3個。測序后經(jīng)氨基酸序列比對，共發(fā)現(xiàn)4個互作蛋白：(1)富含脯氨酸蛋白(riceprolinerichprotein，OsPRP)，含416AA殘基，第54-412AA殘基是一個富含脯氨酸區(qū)域；(2)氨甲酰磷酸合成酶核蛋白體(riceput

6、ativecarbamoylphosphatesynthetasesmallsubunit)，含462AA殘基，第75-222AA殘基為氨甲酰磷酸合成酶結構域，第261-462AA殘基為谷氨酰胺轉移酶Ⅰ結構域；(3)轉氨酶Ⅳ(riceaminotransferaseⅣ)，包含361AA殘基，第244-273AA殘基是轉氨酶Ⅳ的保守序列，第68-343AA殘基是轉氨酶Ⅳ結構域，且該蛋白在OsHsp90的ATPase結構域之后區(qū)域存在結合位