水稻白葉枯病菌無毒基因avrXa23的克隆及與AvrXa23互作的水稻蛋白的功能分析.pdf

1、由黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的水稻白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一，嚴重制約水稻高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)。水稻與Xoo的互作是研究植物與病原物互作的模式系統(tǒng)之一。寄主植物水稻（粳稻品種日本晴和秈稻品種93-11等）和病原菌Xoo（韓國菌株KACC10331、日本菌株MAFF311018和菲律賓菌株P(guān)XO99A等）的全基因組測序已經(jīng)完成，為深入研究水稻與Xoo的互作奠定了生物信息基礎(chǔ)

2、。
　　本實驗室前期利用EZ-Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)，構(gòu)建了白葉枯病原菌PXO99A的突變體庫，通過篩選PXO99A的突變體庫，獲得14個使CBB23感病的突變菌株。在此基礎(chǔ)上，對這14個突變菌株的Tn5插入位點進行側(cè)翼序列分析，發(fā)現(xiàn)有3個菌株Tn5插入在TALE（Transcription activator-like effectors）類基因的位置，這3個菌株分別命名為P99M2、P99M4和P99M5。
　　本論文分為兩部分

3、：第一部分是克隆與水稻白葉枯病廣譜抗病基因Xa23對應的無毒基因avrXa23；第二部分是篩選水稻中與AvrXa23互作的蛋白，并對相關(guān)蛋白及其編碼基因進行功能分析。獲得的主要結(jié)果如下：
　　1.通過篩選PXO99A的Cosmid基因組文庫，獲得34個含有TALE類基因的Cosmid質(zhì)粒（簡稱C1-C34）。將這34個Cosmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到突變體菌P99M5中，發(fā)現(xiàn)C15轉(zhuǎn)化進入P99M5后能夠激發(fā)CBB23的抗病性，說明C15含

4、有與Xa23基因?qū)臒o毒基因。
　　2.經(jīng)過測序分析，發(fā)現(xiàn)C15中含有talC9a和talC9b兩個候選的無毒基因。構(gòu)建talC9a和talC9b的表達載體，分別命名為pHM1-Mi和pHM1-L。pHM1-L轉(zhuǎn)化進入P99M5等突變體菌中能夠使 CBB23抗病，而pHM1-Mi無此功能。說明talC9b是與Xa23相對應的Xoo無毒基因avrXa23。
　　3. avrXa23是TALE類基因，全長4452bp，編碼蛋白

5、含1483氨基酸。通過Southern blot方法，證實avrXa23存在于國內(nèi)外Xoo代表性菌株中。AvrXa23可以激活水稻中抗病基因Xa23的表達，avrXa23的廣泛存在可以解釋Xa23對于白葉枯病菌的廣譜抗病性。
　　4.構(gòu)建PXO99A誘導CBB23的cDNA文庫。以AvrXa23為誘餌，篩選該cDNA文庫，初篩獲得323個侯選克隆。通過測序后排除移碼、復篩進一步驗證獲得43個候選陽性克隆。這43個克隆編碼26種蛋白

6、質(zhì)，其中7個可能與抗病相關(guān)。將這7個基因的cDNA全長擴增并構(gòu)建成prey載體進行酵母雙雜交驗證，然后進行GST pull-down體外驗證，最終證明3個水稻蛋白質(zhì)（OsIMPα、OsTHIC和OsTHI1）與AvrXa23互作。
　　5.生物信息學分析表明，OsIMPα為核轉(zhuǎn)運蛋白，可能輔助AvrXa23進入細胞核；OsTHIC為嘧啶環(huán)前體合成酶，OsTHI1為噻唑合成酶，兩者都是維生素B1合成的關(guān)鍵酶。維生素B1作為植物抗病反

7、應的激活劑，通過水楊酸和Ca2+相關(guān)的信號途徑，使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，對水稻抵抗Xoo的侵染具有重要作用。
　　6.進一步的實驗研究發(fā)現(xiàn)，OsTHI1與 AvrXa23的 N端互作；OsTHI1定位在葉綠體上；利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻近等基因系CBB4（含Xa4，抗白葉枯病原菌PXO61）中的OsTHI1，獲得的轉(zhuǎn)基因植株葉片維生素B1含量下降，且對PXO61感病。
　　總之，本研究成功克隆到對應于Xa23