中藥調(diào)控種子細胞復合生物材料修復骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：各種原因引起的大段骨缺損很難愈合，隨著組織工程學理論與技術的發(fā)展，將具有成骨能力的種子細胞復合可降解生物材料構建成具有生命活力的組織工程人工骨移植到骨缺損處，發(fā)揮骨誘導、骨傳導甚至直接成骨作用，成為這一棘手問題的新的解決方案。 中醫(yī)認為，骨折后如腎生養(yǎng)精髓不足，則無以養(yǎng)骨而難以愈合，中醫(yī)治療骨折促進骨折愈合，無不從補腎壯骨入手。如果能夠證實補腎壯骨中藥具有促進骨髓基質(zhì)細胞(mesenchymai stem cells，MS

2、C)增殖、分化或兩者兼有的功能，就能從骨生長的細胞學層面上闡述這類藥物的具體作用機制和靶點。通過本研究希望解答以下問題：1．中藥骨碎補促進骨折愈合(接骨續(xù)筋)的細胞學機制，即是否是骨髓基質(zhì)細胞—成骨細胞—骨生長—骨愈合的過程，為印證髓滿骨充理論提供依據(jù)；2．中藥參與培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞特性維持的能力，即是否具有穩(wěn)定增殖和傳代的能力；3．中藥參與培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細胞能否分化為成骨細胞，即骨髓基質(zhì)細胞的多潛能分化和定向分化能力的維持；4．骨碎補

3、提取物在細胞培養(yǎng)過程中的量效關系；5．這種特定條件下培養(yǎng)的種子細胞與生物基質(zhì)材料的復合是怎樣的，即能否制成具有生命活性的組織工程人工骨；6．該人工骨植入骨缺損處后的成骨效能如何。 一、骨碎補提取液對兔骨髓基質(zhì)細胞增殖的影響 方法： 1．分組：實驗共分五組：①空白對照組(標準培養(yǎng)液)；②誘導對照組(成骨條件誘導培養(yǎng)液)；③中藥Ⅰ組(含骨碎補20mg/ml的培養(yǎng)液)；④中藥Ⅱ組(含骨碎補2mg/ml的培養(yǎng)液)；⑤中藥

4、Ⅲ組(含骨碎補0.2mg/ml的培養(yǎng)液)。將從2月齡純種新西蘭大白兔提取的骨髓懸液分離漂洗出骨髓基質(zhì)細胞，加入以上培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 結果： 1．細胞生長狀況 中藥Ⅰ組細胞貼壁數(shù)量少，生長緩慢，細胞形態(tài)細長，胞質(zhì)較少，細胞萎縮脫落?？瞻捉M細胞基本呈長梭形，其他各組細胞逐漸增多，伸出偽足，呈梭形、星形、多角形等不同形狀。胞漿內(nèi)有較多小顆粒，核仁明顯，一周左右細胞基本長滿并呈集落存在。 2．細胞活力及生長曲線的測

5、定結果 誘導組與空白組未見顯著性差異，中低濃度提取液有促進骨髓基質(zhì)細胞增殖作用，而低濃度較中濃度作用更強，高濃度提取液抑制骨髓基質(zhì)細胞的增殖，還能導致其凋亡。 3．細胞分裂指數(shù)的測定結果 測量分裂指數(shù)記錄并繪制成曲線，將貼片的細胞行HE染色，中藥Ⅰ組明顯抑制細胞生長，曲線低平。 結論：中低濃度骨碎補提取液促進骨髓基質(zhì)細胞增殖，而高濃度提取液抑制細胞增殖，甚至引起凋亡，條件誘導培養(yǎng)液對細胞增殖的影響不明顯。

6、 二、骨碎補提取液對兔骨髓基質(zhì)細胞分化的影響 方法：骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)同上。 結果： 1．倒置相差顯微鏡觀察 中藥Ⅰ組細胞脫壁漂浮，數(shù)量明顯減少，細胞邊緣粗糙皺縮，核固縮，裂解。中藥Ⅱ、Ⅲ組、誘導對照組細胞呈梭形、多角形，融合為單層后繼續(xù)增殖成復層生長，形成多個島狀致密細胞群，中間細胞排列緊密，漸被含有高折射的空泡和深色顆粒的基質(zhì)包埋形成白色鈣化結節(jié)?？瞻讓φ战M，融合為單層后細胞發(fā)生接觸抑制，最終停

7、止分裂增殖。 2．掃描電鏡觀察 中藥Ⅱ、Ⅲ兩組細胞多為單層細胞結構，細胞為梭形或多角形，帶多個突起，數(shù)目不等，長短粗細各異，可見細長微絲形成細胞間的連接，細胞表面及細胞間可見鈣鹽結晶沉積。 3．堿性磷酸酶染色 中藥Ⅱ、Ⅲ組和誘導組染色陽性率分別為35.6％、31.4％和72.4％，空白組僅為3.6％。誘導組與空白對照組及中藥各組之間有極顯著性差異(P＜0.001)，中藥Ⅱ、Ⅲ組與空白組之間也有極顯著性差異

8、(P＜0.001)，中藥兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。 4．Ⅰ型膠原免疫組織化學染色 各組Ⅰ型膠原在細胞內(nèi)和基質(zhì)均有陽性染色，誘導組與空白組有極顯著性差異(P＜0.001)，中藥Ⅱ、Ⅲ組雖明顯低于誘導組(P＜0.05)，但都明顯或顯著高于空白組(分別為P＜0.05，P＜0.01)，而中藥兩組之間無明顯差異(P＞0.05)。 5．鈣結節(jié)染色 中藥Ⅱ、Ⅲ組在每個標本上均可見到金黃色鈣結節(jié)，低倍視野平均為

9、1～2個，少于誘導組的平均3～4個，而空白組僅偶見鈣結節(jié)。 結論：高濃度骨碎補醇提液引起了BMSCs的死亡或凋亡，不利于BMSCs向成骨細胞分化。中、低濃度骨碎補醇提液具有促進BMSCs向成骨細胞分化的作用。 三、成骨細胞與多孔支架材料的生物相容性研究 方法：傳代增殖的兔成骨細胞制成5×104/ml濃度的細胞懸液，置入已有支架材料的培養(yǎng)板中，使細胞懸液充分滲入支架材料孔隙內(nèi)聯(lián)合培養(yǎng)，8小時后加入條件培養(yǎng)液，其后隔

10、日更換培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)。 結果： 1．倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察 培養(yǎng)7天，緊密貼附于支架表面的成骨細胞分化增殖連接成片，細胞多為梭形、三角形向周圍伸出偽足，分泌的基質(zhì)包繞于細胞周圍，充填于支架材料周邊孔隙中，可見鈣結節(jié)。 2．堿性磷酸酶染色 培養(yǎng)2周鈣鈷法在成骨細胞的胞漿中呈現(xiàn)淺棕色至棕黑色顆粒。 3．成骨細胞在支架材料上的成活和增殖能力 測定值為0.221±0.017，對照組

11、為0.140±0.015，(P〈0.01〉，表明支架有利于細胞的附著和增殖。 結論：成骨細胞在生物支架上分布均勻，粘附力強，并能很好地分化增殖及分泌新的骨基質(zhì)，生物活性玻璃能夠為種子細胞提供良好的載體和生存環(huán)境，二者生物相容性好。 四、組織工程人工骨修復兔骨缺損的實驗研究 方法： 將20只新西蘭大白兔分為4組，在其橈骨缺損處分別植入組織工程人工骨(Ⅰ組)、生物活性玻璃(Ⅱ組)、自體髂骨(Ⅲ組)，每組6只，

12、另2只保留骨缺損作為空白對照組(Ⅳ組)?？p合肌層皮膚包扎。術后每天肌注青霉素，連續(xù)三天，常規(guī)飼養(yǎng)。 結果： 1．大體觀察 12周Ⅰ組骨缺損區(qū)修復良好，與正常骨無差異；Ⅱ組骨缺損初步修復，有少量連續(xù)骨痂通過；Ⅲ組骨缺損完全修復，有連續(xù)性骨痂通過骨折端，質(zhì)地堅硬；Ⅳ組假關節(jié)形成。 2．X線觀察 12周ⅠⅢ組骨缺損完全修復，可見皮質(zhì)骨及髓腔形成，皮質(zhì)骨厚度接近正常骨；Ⅱ組有少量連續(xù)性骨痂通過斷端；Ⅳ組骨

13、端硬化分離，形成假關節(jié)。 3．組織學觀察 12周Ⅰ組移植顆粒間骨橋和小梁狀結構已建立，髓腔進一步開通，逐步恢復自然骨的特點。Ⅱ組顆粒周圍形成少量新骨，顆粒間骨橋連接不緊密，骨小梁也不明顯。 4．掃描電鏡 12周Ⅲ組已形成隆起密集的結合，Ⅰ組分界模糊過渡自然，結合部密集。Ⅱ組也有明顯的修復，但不緊密。Ⅳ組全部為纖維組織，中央有裂隙。 5．生物力學測試結果顯示： Ⅲ組橈骨扭轉強度最高，與Ⅰ組無