重組人成骨蛋白-1植入劑的制備及誘骨活性研究.pdf

1、目的： 骨缺損的治療一直是骨科臨床的難題。骨缺損的治療目前主要是自體骨及異體骨的移植。但它們具有明顯的缺點，如自體骨來源有限，需要兩次手術；而異體骨具有免疫排斥和疾病傳播的缺陷等。骨組織的修復一般認為是特定的靶細胞在特定環(huán)境中經一定的生長因子刺激發(fā)生增殖、分化的結果，即骨形成需要三個條件：1、靶細胞，即具有潛在骨生成能力的未分化間充質細胞：2、具有骨誘導活性的因子：3、骨形成的適宜環(huán)境。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，特別是基因工程技術的成

2、熟，骨生長因子制備技術日臻完善及它的基礎與臨床研究日益深入，為骨缺損的治療提供了新的途徑。 作為骨誘導因子之一的成骨蛋白-1(osteogenic protein-1，OP-1)，又名骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)，具有強大的骨誘導活性，能誘導未分化的間充質干細胞向成骨細胞和成軟骨細胞分化。OP-1還能彌補自體骨和異體骨移植的缺陷，在骨缺損、骨不連、脊柱融合術、矯形缺陷

3、等治療中發(fā)揮重要作用：此外，OP-1在口腔牙周再造、牙槽骨的發(fā)育和重建中也發(fā)揮重要作用。 由于單純rhOP-1在體內容易擴散、降解，在有效的時間內無法作用于更多的靶細胞，因此，rhOP-1的穩(wěn)定緩慢釋放是其成骨作用的前提，rhOP-1緩釋載體是其發(fā)揮生理功能的基礎。理想的載體除能承載rhOP-1并保持其活性外，尚具有良好的生物相容性、同時能保持適當?shù)目障堵识诔晒羌毎佬?。本實驗室已構建了工程菌rhOP-1/pBV221/E．

4、coli DH5a和rhOP-1/pBV221/E．coli BL 21，探索并建立了發(fā)酵、純化、復性等rhOP-1制備工藝，獲得了高純度的有活性的rhOP-1，實驗室其他作者已經探索了其與部分載體材料的復合。前期的實驗證明，rhOP-1/明膠海綿植入劑在小動物上具有良好的骨誘導活性。 本工作以臨床應用為目的，針對臨床口腔科適應癥，選擇易生物降解的生物工程材料，以實驗室已有工藝制備rhOP-1復合植入劑，選擇與人更接近的大動物進

5、一步驗證其骨誘導性，并探討其骨誘導機制，為臨床應用提供基礎依據(jù)。 研究方法： 1．rhOP-1/明膠海綿植入劑制備發(fā)酵基因工程技術構建的工程菌rhOP-1/pBV221/E．coli BL 21和OP-1/pBV221/E．coli DH5a，經超聲裂解法破裂后收集包涵體，通過SP-Sepharose純化后進行梯度透析復性，純化獲得高純度的rhOP-1。將吸收性明膠海綿加工成直徑為5mm、厚度為2mm的圓片狀，與透析復性

6、的rhOP-1混勻后置于冷凍干燥機中凍干，使rhOP-1干粉充分吸附在明膠海綿載體上，制備rhOP-1/明膠海綿植入劑。 2．rhOP-1植入劑對牙槽骨再生的作用本實驗將rhOP-1植入劑應用于犬拔牙創(chuàng)的研究，分別設立對照組和實驗組，于2周、4周、8周時取材，進行大體標本觀察、X線檢測和組織學檢查，觀察rhOP-1體內誘導成骨活性。 3．rhOP-1對骨髓基質干細胞的誘導分化作用本實驗通過體外培養(yǎng)方法獲得骨髓基質干細胞

7、，分別設立對照組和實驗組，利用rhOP-1對其誘導分化，進行堿性磷酸酶(ALP)活性檢測、茜素紅鈣結節(jié)染色觀察rhOP-1體內誘導成骨活性。 4．rhOP-1植入劑對成骨組織的蛋白質組學研究蛋白質組學是以基因組編碼的全部蛋白質為研究對象，旨在從分子水平及整體水平研究蛋白質的組成及其動態(tài)變化規(guī)律，從而深入認識有機體的各種生理和病理過程。 本實驗通過雙向電泳技術研究了rhOP-1/明膠海綿復合體埋植于肌肉組織后對成骨組織的蛋

8、白質組學研究。 研究結果： 1．菌體經發(fā)酵誘導表達后，SDS-PAGE電泳顯示目的蛋白約占菌體蛋白總量的30％，經SP-Sepharose純化后，rhOP-1單體純度高達90％以上，純化后的rhOP-1經梯度透析的方法復性，rhOP-1以單體和二聚體的形式存在。 2．rhOP-1植入劑具有明顯的促進牙槽骨再生的作用，并且可以縮小拔牙創(chuàng)，減少出血，從而促進拔牙創(chuàng)的愈合，可以為早期義齒修復、早期牙種植做準備，而且該材

9、料制作方便，操作簡單，有望經過進一步研究成為臨床促牙槽骨再生的生物材料。 3．rhOP-1成骨作用明顯，在體外有良好的骨誘導活性，為其在組織工程學方面的應用提供了理論基礎。 4．實驗顯示對照組及實驗組凝膠蛋白質點數(shù)分別為732個和784個。這些蛋白質等電點和分子量分布范圍較廣，蛋白質點主要分布在等電點為4-7，分子量為24kD-66kD的范圍。分析發(fā)現(xiàn)，對照組和實驗組之間存在差異蛋白質點共92個差異蛋白質點，其中28個點