重組人IFN-λ1的制備及其抗腫瘤活性的研究.pdf

1、干擾素-λs（Interferon-λ，IFN-λs）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新型干擾素，在氨基酸組成和功能方面與Ⅰ型IFN接近。IFN-λs的受體隸屬于Ⅱ型細(xì)胞因子受體家族(ClassⅡcytokinereceptorfamily,CRF2)，由特有的配基結(jié)合亞基IFN-λR1和輔助亞基IL-10R2組成。盡管IFN-λS與Ⅰ型IFN(IFN-α/β)使用完全不同的受體，但是均可通過(guò)激活JAK-STAT通路傳遞配基結(jié)合信號(hào)，因此IFN-λs

2、顯示出了與Ⅰ型IFN相似的抗病毒，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)活性。值得注意的是，與Ⅰ型IFN受體不同，IFN-λR1的表達(dá)具有組織特異性，在骨髓造血細(xì)胞及腦、脊髓中樞神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)量很低。這一特點(diǎn)使IFN-λs可望成為一種新型的免疫生物制劑，與目前臨床上普遍應(yīng)用的IFN-α相比，在發(fā)揮生物活性的同時(shí)有效地減少發(fā)熱、抑郁及骨髓抑制等副作用。
　　 本組前期工作中，以串聯(lián)多拷貝的形式構(gòu)建IFN-λ1表達(dá)載體并分泌到胞外的形式用畢赤酵母成功的表達(dá)

3、了重組人IFN-λ1（recombinanthumanIFN-λ1，thIFN-λ1），并對(duì)其生物活性進(jìn)行了初步的研究。前期研究表明，thIFN-λ1能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中JAK-STAT信號(hào)通路中STAT蛋白的磷酸化，并對(duì)某些細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用；但存在著重組蛋白thIFN-λ1表達(dá)產(chǎn)量、純化效率有待提高，靶細(xì)胞尚不完全明確等問(wèn)題。本論文在此基礎(chǔ)上，在thIFN-λ1的表達(dá)純化流程的優(yōu)化，理化性質(zhì)的鑒定和抗腫瘤活性以及N糖基化位點(diǎn)突變后

4、的性質(zhì)的觀察等幾個(gè)方面做了進(jìn)一步的研究。
　　 本論文的第一部分工作是利用BMMY培養(yǎng)基高效表達(dá)thIFN-λ1，經(jīng)陽(yáng)離子交換層析(SPSepharoseFastFlow，SPFF)及分子篩層析(Superdex75)兩步柱層析純化，獲得純度較高的thIFN-λ1。對(duì)純化步驟作了產(chǎn)率和純度分析后，又就重組蛋白的分子量、N端序列、等電點(diǎn)、肽質(zhì)量指紋圖譜及二硫鍵位置等理化性質(zhì)做了進(jìn)一步鑒定。此外，本部分工作還研究了thIFN-λ1在

5、體內(nèi)外的抗腫瘤作用。以人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29兩株細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。通過(guò)Real-TimePCR和WesternBlot分析了兩株細(xì)胞中IFN-λR1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)情況。通過(guò)MTT檢測(cè)thIFN-λ1抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)thIFN-λ1對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。此外，thIFN-λ1還能引起兩株細(xì)胞中STAT的磷酸化并誘導(dǎo)兩株細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示thIFN-λ1的抑瘤率有明顯的劑量依賴效應(yīng)

6、，腫瘤抑制率分別達(dá)到52％(HCT116)和56%(HT29)，P值均小于0.01;之后我們對(duì)不同劑量組的腫瘤進(jìn)行了Ki-67的免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著干擾素劑量的增加Ki-67指數(shù)呈明顯的下降趨勢(shì)。此外，我們還做了脾臟組織的HE染色和CD45R和CD3的免疫組化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明脾臟中的B細(xì)胞生發(fā)中心明顯增大，數(shù)量也明顯增多，但由于所用裸鼠為T(mén)細(xì)胞免疫缺陷，所以未發(fā)現(xiàn)CD3明顯變化。
　　 本論文的第二部分工作是利用重疊延伸PC

7、R定點(diǎn)突變技術(shù)將IFN-λ1蛋白質(zhì)序列中N-糖基化位點(diǎn)46位Asn（天冬酰胺）突變?yōu)榕c其具有相似結(jié)構(gòu)的Gln（谷氨酰胺），并構(gòu)建了6拷貝IFN-λ1-Nm(N46Q)表達(dá)載體，在轉(zhuǎn)化的畢赤酵母中分泌性表達(dá)了重組蛋白，并通過(guò)SPFF和Superdex75兩步層析，獲得了高純度的低糖化重組人IFN-λ1（IFN-λ1-Nm）。理化性質(zhì)的鑒定顯示thIFN-λ1的N-糖基化位點(diǎn)突變后對(duì)其理化性質(zhì)并無(wú)明顯影響。通過(guò)對(duì)細(xì)胞表面HLA-ABC表達(dá)的