促性腺激素釋放激素在斑節(jié)對(duì)蝦中的免疫定位及功能.pdf

1、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）是我國(guó)重要的傳統(tǒng)養(yǎng)殖蝦類，但由于對(duì)其性腺發(fā)育調(diào)控機(jī)制的了解不清晰，育種過(guò)程中缺乏人工可控的性腺催熟技術(shù)，育種技術(shù)理論的升級(jí)受到制約。因此，了解性腺發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制，探索發(fā)育相關(guān)激素的分泌規(guī)律及作用機(jī)制有重要意義。促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)是一種十到十二肽的神經(jīng)激素，在動(dòng)物的繁育中發(fā)揮重要作用。為了獲知GnRH的在斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系

2、統(tǒng)中的分泌規(guī)律、功能和作用機(jī)制，本研究利用組織切片，免疫組化，體外組織培養(yǎng)，反向液相色譜等方法研究了GnRH在斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)中的分布及變化，確定了GnRH對(duì)卵巢發(fā)育成熟的誘導(dǎo)作用，并初步建立了斑節(jié)對(duì)蝦GnRH分離純化的方法。具體研究結(jié)果如下：
　?。?）斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)和卵巢組織結(jié)構(gòu)
　　通過(guò)石蠟切片，HE染色的技術(shù)研究了斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)及卵巢的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)是由腦，圍食道神經(jīng)，胸神經(jīng)及腹神經(jīng)

3、節(jié)高度愈合而成，腦位于眼柄基部，由前腦，中腦，后腦和相連的神經(jīng)束組成，腦中神經(jīng)分泌細(xì)胞根據(jù)直徑分為三類，分別為小型，中型及大型神經(jīng)分泌細(xì)胞，根據(jù)在腦中的分布位置分為6-17神經(jīng)分泌細(xì)胞群。在食道下神經(jīng)，胸腹神各神經(jīng)節(jié)也是由神經(jīng)纖維及神經(jīng)分泌細(xì)胞組成。斑節(jié)對(duì)蝦卵巢分為六個(gè)期，其中成熟期（V期）卵子呈皮質(zhì)桿狀體。卵巢具有自發(fā)熒光現(xiàn)象，主要集中于濾泡細(xì)胞以及富含卵黃顆粒的次級(jí)卵母細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域,熒光強(qiáng)度與卵巢發(fā)育階段具有顯著正

4、相關(guān)性（P<0.01）?？筛鶕?jù)熒光強(qiáng)度初步判斷卵巢發(fā)育分期。
　?。?） GnRH在斑節(jié)對(duì)蝦生殖發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)及卵巢中免疫定位
　　利用免疫組化及定量PCR的方法研究了GnRH在斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育五個(gè)時(shí)期（II至VI期）中在神經(jīng)系統(tǒng)及卵巢中的免疫定位，以及在卵巢和肝胰腺中卵黃蛋白原的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示陽(yáng)性信號(hào)主要分布于腦、胸神經(jīng)節(jié)的一些中型神經(jīng)分泌細(xì)胞群，并且 GnRH免疫陽(yáng)性在各神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)纖維中普遍分布，同時(shí)在次級(jí)卵母細(xì)胞

5、也檢測(cè)到免疫陽(yáng)性。其次，GnRH-I類似物在斑節(jié)對(duì)蝦 III期腦組織中顯示較強(qiáng)的免疫陽(yáng)性，顯著聚集在中型神經(jīng)分泌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)高表達(dá)水平；然而在卵巢中 GnRH-I類似物僅在成熟期 V期次級(jí)卵母細(xì)胞與初級(jí)卵母細(xì)胞的細(xì)胞間隙中發(fā)現(xiàn)免疫陽(yáng)性。定量PCR結(jié)果顯示在發(fā)育不同時(shí)期中，肝胰腺卵黃蛋白原mRNA表達(dá)趨勢(shì)與卵巢中不同，提示斑節(jié)對(duì)蝦神經(jīng)系統(tǒng)分泌GnRH-I型類似物，誘導(dǎo)卵巢成熟，在此過(guò)程中，肝胰腺卵黃蛋白原向卵巢轉(zhuǎn)移。
　?。?

6、）GnRH體外培養(yǎng)對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的影響
　　采用離體卵巢組織培養(yǎng)的方法研究了中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）促性腺激素釋放激素（EsGnRH-I）、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)促性腺激素釋放激素（PcGnRH），多巴胺拮抗物地歐酮（DOM）及神經(jīng)組織對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦卵巢發(fā)育的調(diào)控作用效果。結(jié)果表明：50 ng?ml-1 EsGnRH-I，500 ng?ml-1 PcGnRH，0.3μg?ml

7、-1 DOM對(duì)離體卵巢的發(fā)育有明顯的刺激作用，顯著增大卵母細(xì)胞直徑（P<0.01），與腦組織，胸神經(jīng)處理組效果相似；同時(shí)組合使用 PcGnRH和DOM能極顯著促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育（P<0.01）。熒光定量PCR結(jié)果顯示PcGnRH和DOM處理后能顯著增加卵黃蛋白原的積累量。說(shuō)明甲殼類動(dòng)物 GnRH和DOM均能促進(jìn)斑節(jié)對(duì)蝦卵母細(xì)胞成熟，并具有協(xié)同作用。
　?。?）斑節(jié)對(duì)蝦腦組織GnRH的初步分離純化
　　采用反向液相色譜的方法對(duì)斑