植物與病毒互作機(jī)理研究的遺傳分離.pdf

1、在長(zhǎng)久以來(lái)的進(jìn)化中，植物發(fā)展出一系列對(duì)病毒的免疫機(jī)制，其中包括:R基因介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制，RNA沉默(RNA silencing)，凝集素蛋白介導(dǎo)的抗病毒機(jī)制和其他一些寄主蛋白如一些翻譯起始因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白等;另一方面，植物病毒為能成功侵染植物，或通過(guò)突變、重組等使自身進(jìn)化，或通過(guò)編碼蛋白如RNA沉默抑制子來(lái)抵抗植物的免疫防衛(wèi)反應(yīng)。本文分別從這兩方面闡述植物與病毒互作機(jī)理:一方面以蘋(píng)果莖痘病毒(Apple stem pitting vir

2、us, ASPV)病毒為研究對(duì)象闡述病毒抵抗寄主植物的免疫反應(yīng)機(jī)理，另一方面以煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）和模式植物擬南芥互作系統(tǒng)為研究對(duì)象，探索植物對(duì)病毒的免疫反應(yīng)機(jī)理。分別取得了如下研究結(jié)果:
　　1.源于梨的ASPV分子變異及遺傳進(jìn)化分析
　　為了明確我國(guó)梨樹(shù)上ASPV群體結(jié)構(gòu)以及分子進(jìn)化機(jī)制，本研究從國(guó)內(nèi)不同的的梨產(chǎn)區(qū)采集總共451份梨樹(shù)樣品進(jìn)行ASPV檢測(cè)，共檢測(cè)到145份ASP

3、V陽(yáng)性樣品，克隆部分陽(yáng)性樣品完整CP（31份），TGB(44份)和部分RdRp片段(P1和P2)（3份）。其中測(cè)序了來(lái)源于31個(gè)分離物的169個(gè)CP克隆，44個(gè)分離物的95個(gè)TGB克隆，RdRp的部分片段P1和P2分別測(cè)序了來(lái)源于3個(gè)分離物的17和14個(gè)克隆。分別基于本研究測(cè)序的這三個(gè)基因序列以及GenBank上報(bào)道的序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明:1）ASPV在進(jìn)化樹(shù)上的分組與寄主（蘋(píng)果，梨和來(lái)自中國(guó)新疆的庫(kù)爾勒香梨）存在相關(guān)性;2）來(lái)源于

4、梨分離物的ASPV CP序列在進(jìn)化樹(shù)被上分為6個(gè)亞組(A-F)，其中B和F亞組序列在本研究中首次報(bào)道;3）本研究首次系統(tǒng)研究ASPV TGB基因序列，在進(jìn)化樹(shù)上將其分為5個(gè)小組。序列多重比對(duì)結(jié)果表明源于梨分離物的ASPV CP和RdRP序列存在連續(xù)的核苷酸插入或者缺失。重組分析結(jié)果表明本研究測(cè)序的完整CP，TGB和部分RdRp片段(P2)中均檢測(cè)到重組事件。選擇壓力分析結(jié)果表明ASPV CP和TGB在自然進(jìn)化過(guò)程中被負(fù)向壓力選擇(Neg

5、ative Selection)。以上結(jié)果表明堿基突變（插入或者缺失）、重組和負(fù)向選擇壓力是我國(guó)ASPV群體結(jié)構(gòu)多樣性的主要原因。
　　2.ASPV沙梨分離物HB-HN1全長(zhǎng)和vsiRNA特性分析
　　本研究擴(kuò)增了湖北省某果園的沙梨（二十世紀(jì)）樣品的ASPV基因組全長(zhǎng)(9270nt，除去polyA尾)，命名為HB-HN1。HB-HN1與已經(jīng)報(bào)道的11個(gè)ASPV分離物的全長(zhǎng)核苷酸序列相似性在72.4％-80.0％之間。將12個(gè)

6、ASPV全長(zhǎng)的5個(gè)基因序列分別進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同的基因比對(duì)結(jié)果與全長(zhǎng)的相似性存在差異。ASPV基因組的5'端非翻譯區(qū)相對(duì)保守而3端非翻譯區(qū)則變異相對(duì)較大。基于這12個(gè)ASPV分離物全長(zhǎng)核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明:ASPV在進(jìn)化樹(shù)上的分組與寄主有關(guān)。分析ASPV-vsiRNAs的結(jié)果表明ASPV正負(fù)鏈RNAs在生成vsiRNAs時(shí)貢獻(xiàn)相當(dāng)（分別是59.1％和40.9％），而且這些vsiRNAs幾乎平均分布在ASPV整個(gè)基因組。AS

7、PV-vsiRNAs5'端堿基偏向性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了常見(jiàn)的5'端A和U偏向性，本研究中出現(xiàn)vsiRNAs5'端C的偏向性的幾率也很大。
　　3.源于不同分離物的ASPV編碼蛋白功能多樣性分析
　　本研究構(gòu)建了ASPV CP5個(gè)梨分離物(HB-HN1-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、HB-HN9-3、YN-MRS-17)和1個(gè)蘋(píng)果分離物（LN-AP-1）的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中特定條件下(30℃，含50 mg/

8、L Kan，1 mM/L IPTG的LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)6 h)可以高效的表達(dá)ASPV不同分離物重組外殼蛋白。重組CP經(jīng)純化后免疫大耳白兔，制備了ASPV3個(gè)不同分離物的多克隆抗血清，分別命名為PAb-HB-HN9-3，PAb-HB-HN6-8和PAb-YN-MRS-17。Western-blot結(jié)果表明本研究制備的3個(gè)不同抗血清在檢測(cè)ASPV不同分離物（HB-HN1-3、HB-HN7-18、HB-HN6-8、H-B-HN9-3、YN-

9、MRS-17和LN-AP-1）原核表達(dá)蛋白時(shí)反應(yīng)強(qiáng)度存在明顯差異。RNA沉默抑制子鑒定的結(jié)果表明ASPV CP具有抑制RNA沉默功能。利用PVX病毒載體表達(dá)ASPVCP(PVX-ASPV-CP)，將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種接種西方煙，發(fā)現(xiàn)相比PVX(wt)，PVX-ASPV-CP能夠在西方煙上引起嚴(yán)重的癥狀。本研究通過(guò)分析ASPV不同分離物CP沉默抑制功能以及在西方煙上的致病性，發(fā)現(xiàn)不同分離物CP分子變異并不影響CP

10、抑制RNA沉默功能及其在西方煙上的致病性。然而，ASPV TGB3不同分離物分子變異卻影響了其編碼蛋白跨膜區(qū)域。
　　4.RNA沉默和P-bodies相關(guān)組分在病毒Recovery以及VIGS過(guò)程中扮演的作用
　　RNA沉默是植物主要的抗病毒機(jī)制之一。病毒誘導(dǎo)的RNA沉默的原理就是植物體內(nèi)的Dicer-like酶識(shí)別病毒的dsRNA并將其切割成siRNA，隨后這些siRNA與AGO蛋白家族結(jié)合并引導(dǎo)這些蛋白靶標(biāo)目標(biāo)同源RNA

11、。在植物病毒研究領(lǐng)域，一方面RNA沉默的機(jī)制很長(zhǎng)一段時(shí)間解釋了病毒的Recovery現(xiàn)象，認(rèn)為植物通過(guò)RNA沉默機(jī)制沉默了病毒RNAs導(dǎo)致植物從病毒引起的癥狀中Recovery;另外一方面病毒誘導(dǎo)的RNA沉默用來(lái)沉默植物的內(nèi)源基因(virus-induced gene silencing，VIGS)。雖然Recovery和VIGS的機(jī)理被認(rèn)為基于RNA沉默，但是引起這兩種現(xiàn)象的真正機(jī)理尚不清楚。本研究采用目前應(yīng)用非常廣泛的煙草脆裂病毒沉

12、默載體(Tobacco rattle virus，TRV)作為研究工具，為達(dá)到研究的目的，將擬南芥內(nèi)源基因八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)和外源基因綠色熒光蛋白基因(greenfluorescent protein, GFP)插入該病毒載體，分別作為VIGS以及Recovery的研究工具。研究結(jié)果顯示AGO2和AGO4在擬南芥中起到抵抗TRV的作用而AGO1卻參與病毒介導(dǎo)的內(nèi)源基因的沉默。然而所有接種