水稻瘤矮病毒P3與Pns9互作研究.pdf

1、水稻瘤矮病是我國(guó)華南地區(qū)發(fā)生較為普遍的病害之一，該病由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus, RGDV)引起。RGDV的基因組全序列已測(cè)定，對(duì)各基因片段所編碼的蛋白功能亦有所了解，但有關(guān)RGDV各基因之間的互作機(jī)制及其與寄主水稻的互作的尚不清楚。RGDV基因組由12個(gè)dsRNA片段組成，除S9片編碼2個(gè)蛋白外，其他片段均編碼單一蛋白。本文應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)研究水稻瘤矮病病毒結(jié)構(gòu)蛋白P3與非結(jié)構(gòu)蛋白

2、Pns9之間互作關(guān)系及互作區(qū)域；以RGDV S3編碼的基因片段P3為誘餌，篩選水稻cDNA文庫，獲得了與P3互作的一種水稻蛋白，即含天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白(eukaryoticaspartyl protease domain containing protein, ASP)。
　　 為了驗(yàn)證RGDV的P3與Pns9之間的互作，提取水稻幼嫩葉片總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增，而獲得水稻瘤矮病毒基因S3和S9全長(zhǎng)序列，將其連接到

3、pGADT7、pGBKT7酵母雙雜交載體，構(gòu)建成重組子pGAD-S9、pGAD-S3和pGBK-S3、pGBK-S9。將誘餌重組質(zhì)粒pGAD-S3、pGBK- S3和pGAD-S9、pGBK-S9重組質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109中，涂布不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇性培養(yǎng)基平板上，顯示RGDV P3與Pns9的互作情況。結(jié)果表明，S3基因編碼的P3蛋白能和S9基因編碼的Pns9發(fā)生互作。以構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體pGBK-S3、pGBK-S9為模板，

4、分別擴(kuò)增獲得融合YGFP基因的水稻瘤矮病毒S3和S9基因，并插入Bifc載體pSPYNE-35S， pSPYCE-35S，構(gòu)建成重組載體pSPYNE-S3、pSPYCE-S3、pSPYNE-S9、pSPYCE-S9，然后將重組Bifc載體重組子分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，注射煙草，觀察煙草中瞬時(shí)表達(dá)情況，確定蛋白的互作情況。雙分子熒光互補(bǔ)檢測(cè)得到的結(jié)果與酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，蛋白P3與Pns9存在互作作用。在病毒粒子中P3內(nèi)層衣殼蛋白能夠與非結(jié)

5、構(gòu)蛋白Pns9互作。本文還在RGDV P3與Pns9之間互作的基礎(chǔ)上，將S3和S9基因分通過PCR擴(kuò)增獲得水稻瘤矮病毒基因S3的三個(gè)突變體和S9三個(gè)突變體，S3所編碼蛋白P3的N1端缺少60bp、N2端缺少120bp、 N3端缺少180bp， S9所編碼蛋白Pns9的N1端缺少150bp、N2端缺少300bp、N3端缺少510bp，用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)一步確定其互作的活性部位。實(shí)驗(yàn)表明，P3的N端第20個(gè)氨基酸至40個(gè)氨基酸與Pns9的N

6、端第1個(gè)氨基酸至50個(gè)氨基酸所編碼蛋白為兩者互作的區(qū)域。
　　 最后，用酵母雙雜交技術(shù)用蛋白P3篩選水稻cDNA文庫，篩選出ASP蛋白，進(jìn)一步用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證P3蛋白與ASP蛋白之間的作用，其結(jié)果為不互作，P3蛋白與水稻ASP蛋白的互作情況有待進(jìn)一步使用其它方法驗(yàn)證。
　　 綜上所述，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)技術(shù)確定RGDV功能蛋白P3和非結(jié)構(gòu)蛋白Pns9存在互作，并確定RGDV P3蛋白N端第20個(gè)氨