病毒感染與PDK1 SUMO化修飾的互作研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1,PDPK1or PDK1)屬于AGC蛋白激酶家族(cAMP和cGMP依賴性的蛋白激酶C)的一員,它能磷酸化下游的許多蛋白,如Akt、p90RSK、p70S6K、SGK和PKC等。因此PDK1的活性對下游激酶以及各細胞功能有著重要的影響,但是病毒感染是否影響PDK1的活性,尚不可知。為了解病毒感染是如何影響PDK1的活性

2、,檢測了不同病毒感染刺激對PDK1活性的影響。發(fā)現(xiàn)禽流感病毒、禽雙RNA病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病毒分別感染293T,293T/DF-1和PK-15細胞,均能誘導一條分子量為210kDa左右的PDK1修飾條帶,進一步的實驗證實,此條帶為SUMO化修飾的PDK1。過表達FLAGPDK1和HASUMO1后,感染IBDV,并于感染后1、3、6、12h收樣進行IP,通過FLAG抗體來釣,并用抗HA抗體來檢測,可以在210KD左右的位置檢測

3、到條帶,進一步證明PDK1的SUMO化修飾。通過網(wǎng)站預測到PDK1的SUMO化修飾位點分別為第207位、第296位和第495位賴氨酸,將這三個位點的賴氨酸同時突變?yōu)榫彼岷?,PDK1的SUMO化修飾水平大大下降。同時還發(fā)現(xiàn)PDK1點突變后能夠抑制下游AKT和S6K的磷酸化。此外,轉(zhuǎn)染VP3的細胞中,AKT和S6K的磷酸化水平均明顯上調(diào)。因此,本研究內(nèi)容顯示,病毒感染能夠誘導PDK1的SUMO化修飾,并且PDK1的SUMO化修飾對下游AK

4、T和S6K的磷酸化活性有著重要的影響。
  既然PDK1的SUMO化修飾在胞內(nèi)有著重要的作用,那么胞內(nèi)調(diào)控PDK1SUMO化的機制就尤為重要。用PDK1作為誘餌蛋白來釣取胞內(nèi)蛋白,發(fā)現(xiàn)PDK1能釣下110KD左右的條帶,經(jīng)過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)這個條帶為VPS34。采用CO-IP技術(shù)和PULL DOWN技術(shù)驗證了PDK1和VPS34的互作為直接互作。迸一步實驗證明過表達VPS34能夠抑制PDK1的SUMO1修飾。同時發(fā)現(xiàn)VPS34能夠破壞

5、PDK1與UBC9的互作,從而抑制UBC9催化PDK1的SUMO化修飾。因此,研究表明VPS34能夠負調(diào)控PDK1的SUMO化修飾。
  SUMO化對于PDK1蛋白功能的發(fā)揮具有重要作用,但是PDK1的SUMO化修飾對于調(diào)控其底物AKT活性的機制目前尚不清楚。超高分辨結(jié)果顯示,PDK1的SUMO化修飾能夠促進PDK1轉(zhuǎn)移至膜周,并且和AKT定位在一塊。免疫共沉淀結(jié)果進一步確認了SUMO化能夠促進PDK1和AKT的互作。而PDK1和

6、AKT的互作對于AKT的磷酸化是必須的。另外,研究表明IBDV通過VP3與VPS34互作,從而破壞了VPS34和PDK1的互作,并因此促進了PDK1的SUMO化。對VP3的功能域進行分析,發(fā)現(xiàn)VP3通過CC3結(jié)構(gòu)域與VPS34發(fā)生互作。而VP3通過CC1結(jié)構(gòu)域與Beclin-1發(fā)生互作。但是VP3是通過CC3來調(diào)節(jié)PDK1修飾條帶和AKT的活性。因此可以判定VP3是通過VPS34,而非Beclin-1來調(diào)節(jié)AKT的活性。同時研究還表明,

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