葛根素微生物糖基化作用小試及固定化酶研究.pdf

1、葛根素(puerarin),4’,7-二羥基-8-β-D-葡萄糖基異黃酮(8-C-β-D-Glucopyranosyl-7,4'-hydroxy—Isoflavone),目前在臨床上廣泛應用于心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、急性酒精中毒及腫瘤等疾病的治療,但是存在水溶解度低和生物利用度低等缺點。對葛根素結構進行修飾改造,改善其水溶性和脂溶性,提高其生物利用度及選擇性,最終增強其藥理活性,是當前葛根素研究的熱點。
　　 本實驗室丁娟芳和

2、蔣潔蓉等人篩選得到一株氧化微桿菌Microbacteriumoxydans CGMCC1788,通過該菌的靜息細胞及細胞提取液轉化可以將葛根素轉化為葛根素-7-O-葡萄糖苷。丁娟芳結合多種蛋白純化方法從該菌中分離純化得到葛根素糖基化酶,并研究了其酶學性質。于賜剛利用乙醇滲透化處理該菌細胞,發(fā)現(xiàn)可將葛根素轉化為葛根素-7-O-果糖苷。
　　 本文采用正交設計法優(yōu)化了工業(yè)培養(yǎng)基,利用5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)氧化微桿菌,細胞經(jīng)乙醇滲透化處理2

3、h,大量制備葛根素-7-O-果糖苷。采用雙柱串聯(lián)層析系統(tǒng)分離純化葛根素-7-O-果糖苷,以10％乙醇作為洗脫液,10 mL/min流速洗脫,收集液經(jīng)濃縮干燥,最終得到了葛根素-7-O-果糖苷晶體3.84 g,HPLC檢測純度達97％。
　　 本文比較了DEAE-纖維素、CM-纖維素對葛根素糖基化酶的固定效果,結果表明DEAE-纖維素固定化載體的酶活高出CM-纖維素固定化載體3.6倍,由此選定DEAE-纖維素作為固定化載體。本文也

4、嘗試了DEAE-纖維素的戊二醛交聯(lián)固定化技術,結果表明交聯(lián)載體經(jīng)0.5mol/L的NaCl溶液解吸后,酶活損失率為85％左右,未達到固定化目的。
　　 以DEAE-纖維素為載體,通過傳統(tǒng)的離子吸附法固定化葛根素糖基化酶,從加酶量、吸附pH方面分析考察對固定化的影響,確定最佳固定化條件為:0.5gDEAE-纖維素,加酶量為12mg/g DEAE-纖維素,吸附pH為8.0。固定化載體酶活為1.2U,活力回收率達到54.8％。