骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、中藥骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨(Drynaria Fortunei(Kunze)J.Sm.，DFS)或中華槲蕨(D.baronii(Christ)Diel.)的干燥根莖，是中醫(yī)骨傷科方劑中常用的主藥，具有促進(jìn)骨折愈合、強(qiáng)骨補(bǔ)腎的功效，在牙周病的治療上也多有運(yùn)用。現(xiàn)代中藥藥物化學(xué)研究證實(shí)骨碎補(bǔ)中的有效成分主要為一種黃酮類化合物——柚皮苷(naringin)。近年來(lái)的研究證實(shí)：含骨碎補(bǔ)的一些復(fù)方藥物對(duì)牙周病具有較好的臨床治療效果，但是其對(duì)牙周

2、病的治療作用機(jī)理尚不清晰。人牙周膜細(xì)胞(human periodontal ligamentceii，hPDLC)作為牙周組織中的主要功能細(xì)胞，具有多向分化潛能，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生中發(fā)揮著重要作用。 為了明了骨碎補(bǔ)在牙周病治療中的作用機(jī)理，本試驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究骨碎補(bǔ)有效藥物成分——柚皮苷對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性以及超微結(jié)構(gòu)的影響，初步探討骨碎補(bǔ)在牙周病治療中的作用機(jī)制，為更好的開(kāi)發(fā)利用骨碎補(bǔ)在牙周病的治療方面

3、的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 本研究分為四部分，第一部分為人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定。采用酶消化法結(jié)合組織塊法，體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞。并采用免疫組織化學(xué)鑒定法鑒定培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞，結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)的組織塊周圍6天后可以見(jiàn)有細(xì)胞爬出。第4代細(xì)胞的免疫組織化學(xué)鑒定法鑒定：抗波形絲蛋白多克隆抗體(VIM)在細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，抗細(xì)胞角蛋白(cK)染色陰性，證實(shí)了細(xì)胞的間葉源性，而非上皮源性。表明本實(shí)驗(yàn)成功地培養(yǎng)了人牙周膜細(xì)胞。 第二部分為

4、骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖影響的研究。采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolil tetracolium，MTT)微量酶反應(yīng)比色法評(píng)價(jià)骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖的影響。采用第4代hPDLC，用0.25％胰蛋白酶消化后記數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10<'4>／ml，接種于96孔培養(yǎng)板。24h后，按照分組分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基(含骨碎補(bǔ)柚皮苷100mg／L、10mg／L、1.0mg／L、0.1mg／L、0.0lmg／L)

5、，對(duì)照組為僅含10ml／L FBS的細(xì)胞培養(yǎng)基，每組3孔。第1天、3天、5天、7天、9天分別進(jìn)行MTT測(cè)驗(yàn)。結(jié)果表明，10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三種濃度的骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)于PDLC有促進(jìn)增殖作用。100mg／L和0.01mg／L兩種濃度無(wú)明顯促進(jìn)hPDLC增殖的作用。 第三部分為骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPDLC堿性磷酸酶活性的影響。采用國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)(International Federation of Clinic

6、al Chemistry，IFCC)推薦方法測(cè)定骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPDLC堿性磷酸酶活性的影響，從而反映骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPDLC功能的影響。采用第5代hPDLC，0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10<'5>／ml，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種細(xì)胞懸液3m1。24h后，按照分組，分別加入含不同濃度骨碎補(bǔ)柚皮苷的細(xì)胞培養(yǎng)基(100mg／L、lOmg／L、1.0mg／L、0.1mg／L、0.0lmg／L)，對(duì)照組為僅含10m1／L

7、 FBS的DMEM，每組復(fù)3孔。5天后，收集細(xì)胞，-20℃凍融3次后，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析儀，測(cè)定hPSDLC堿性磷酸酶活性；并用考馬氏亮蘭微板法，定量測(cè)定樣本中蛋白量，從而求得每毫克凍融蛋白中所含的堿性磷酸酶比活性。結(jié)果表明：濃度為100mg／L到0.1mg/L的骨碎補(bǔ)柚皮苷均有促進(jìn)hPDLC的ALP活性的能力，以1.0mg/L濃度的促進(jìn)作用最強(qiáng)。說(shuō)明骨碎補(bǔ)柚皮苷具有能夠促進(jìn)hPD[。C功能的能力。

8、第四部分為骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPDLC超微結(jié)構(gòu)的影響。采用高分辨率透射分析電子顯微鏡觀察骨碎補(bǔ)柚皮苷作用于hPDLC后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。采用第6代hPDLC，用0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105／ml，接種于75ml大培養(yǎng)瓶，每瓶接種細(xì)胞懸液6ml，共接種6瓶，隨機(jī)分為2組，每組3瓶。24h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入含骨碎補(bǔ)柚皮苷1mg／L的DMEM培養(yǎng)液6ml，對(duì)照組為僅含10ml／L FBS的DMEM 6

9、ml。繼續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育5天后，收集細(xì)胞，包埋、切片、染色后，日立H-600IV型透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)柚皮苷作用于人牙周膜細(xì)胞后，細(xì)胞胞漿內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多，核糖體明顯增多。說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)、合成蛋白質(zhì)功能旺盛。 綜上所述，本研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從細(xì)胞生物學(xué)水平上研究了中藥骨碎補(bǔ)的有效藥物成分——骨碎補(bǔ)柚皮苷——對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖、堿性磷酸酶活性、以及超微結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)柚皮苷對(duì)hPD