骨碎補柚皮苷對人牙周膜細胞增殖、堿性磷酸酶活性及超微結(jié)構(gòu)的影響.pdf

1、中藥骨碎補為水龍骨科植物槲蕨(Drynaria Fortunei(Kunze)J.Sm.，DFS)或中華槲蕨(D.baronii(Christ)Diel.)的干燥根莖，是中醫(yī)骨傷科方劑中常用的主藥，具有促進骨折愈合、強骨補腎的功效，在牙周病的治療上也多有運用?，F(xiàn)代中藥藥物化學(xué)研究證實骨碎補中的有效成分主要為一種黃酮類化合物——柚皮苷(naringin)。近年來的研究證實：含骨碎補的一些復(fù)方藥物對牙周病具有較好的臨床治療效果，但是其對牙周

2、病的治療作用機理尚不清晰。人牙周膜細胞(human periodontal ligamentceii，hPDLC)作為牙周組織中的主要功能細胞，具有多向分化潛能，在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生中發(fā)揮著重要作用。 為了明了骨碎補在牙周病治療中的作用機理，本試驗采用細胞培養(yǎng)技術(shù)，研究骨碎補有效藥物成分——柚皮苷對牙周膜細胞增殖、堿性磷酸酶活性以及超微結(jié)構(gòu)的影響，初步探討骨碎補在牙周病治療中的作用機制，為更好的開發(fā)利用骨碎補在牙周病的治療方面

3、的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 本研究分為四部分，第一部分為人牙周膜細胞的體外培養(yǎng)和鑒定。采用酶消化法結(jié)合組織塊法，體外培養(yǎng)人牙周膜細胞。并采用免疫組織化學(xué)鑒定法鑒定培養(yǎng)出來的細胞，結(jié)果顯示：原代培養(yǎng)的組織塊周圍6天后可以見有細胞爬出。第4代細胞的免疫組織化學(xué)鑒定法鑒定：抗波形絲蛋白多克隆抗體(VIM)在細胞中呈陽性表達，抗細胞角蛋白(cK)染色陰性，證實了細胞的間葉源性，而非上皮源性。表明本實驗成功地培養(yǎng)了人牙周膜細胞。 第二部分為

4、骨碎補柚皮苷對人牙周膜細胞增殖影響的研究。采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolil tetracolium，MTT)微量酶反應(yīng)比色法評價骨碎補柚皮苷對人牙周膜細胞增殖的影響。采用第4代hPDLC，用0.25％胰蛋白酶消化后記數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×10<'4>／ml，接種于96孔培養(yǎng)板。24h后，按照分組分別加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基(含骨碎補柚皮苷100mg／L、10mg／L、1.0mg／L、0.1mg／L、0.0lmg／L)

5、，對照組為僅含10ml／L FBS的細胞培養(yǎng)基，每組3孔。第1天、3天、5天、7天、9天分別進行MTT測驗。結(jié)果表明，10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三種濃度的骨碎補柚皮苷對于PDLC有促進增殖作用。100mg／L和0.01mg／L兩種濃度無明顯促進hPDLC增殖的作用。 第三部分為骨碎補柚皮苷對hPDLC堿性磷酸酶活性的影響。采用國際臨床化學(xué)聯(lián)合會(International Federation of Clinic

6、al Chemistry，IFCC)推薦方法測定骨碎補柚皮苷對hPDLC堿性磷酸酶活性的影響，從而反映骨碎補柚皮苷對hPDLC功能的影響。采用第5代hPDLC，0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至1×10<'5>／ml，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種細胞懸液3m1。24h后，按照分組，分別加入含不同濃度骨碎補柚皮苷的細胞培養(yǎng)基(100mg／L、lOmg／L、1.0mg／L、0.1mg／L、0.0lmg／L)，對照組為僅含10m1／L

7、 FBS的DMEM，每組復(fù)3孔。5天后，收集細胞，-20℃凍融3次后，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析儀，測定hPSDLC堿性磷酸酶活性；并用考馬氏亮蘭微板法，定量測定樣本中蛋白量，從而求得每毫克凍融蛋白中所含的堿性磷酸酶比活性。結(jié)果表明：濃度為100mg／L到0.1mg/L的骨碎補柚皮苷均有促進hPDLC的ALP活性的能力，以1.0mg/L濃度的促進作用最強。說明骨碎補柚皮苷具有能夠促進hPD[。C功能的能力。

8、第四部分為骨碎補柚皮苷對hPDLC超微結(jié)構(gòu)的影響。采用高分辨率透射分析電子顯微鏡觀察骨碎補柚皮苷作用于hPDLC后細胞超微結(jié)構(gòu)的變化。采用第6代hPDLC，用0.25％胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至5×105／ml，接種于75ml大培養(yǎng)瓶，每瓶接種細胞懸液6ml，共接種6瓶，隨機分為2組，每組3瓶。24h后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細胞，實驗組加入含骨碎補柚皮苷1mg／L的DMEM培養(yǎng)液6ml，對照組為僅含10ml／L FBS的DMEM 6

9、ml。繼續(xù)在標準環(huán)境下孵育5天后，收集細胞，包埋、切片、染色后，日立H-600IV型透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，骨碎補柚皮苷作用于人牙周膜細胞后，細胞胞漿內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯增多，核糖體明顯增多。說明細胞生長、合成蛋白質(zhì)功能旺盛。 綜上所述，本研究通過體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，從細胞生物學(xué)水平上研究了中藥骨碎補的有效藥物成分——骨碎補柚皮苷——對人牙周膜細胞增殖、堿性磷酸酶活性、以及超微結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)骨碎補柚皮苷對hPD