堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定

1、堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定堿性磷酸酶米氏常數(shù)的測定【實驗目的】通過堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）米氏常數(shù)的測定，了解其測定方法和意義。學會運用標準曲線測定酶的活性及觀察抑制劑對酶促反應動力學的影響，加深對酶促反應動力學的理解。【實驗原理】本實驗以磷酸苯二鈉為底物，由堿性磷酸酶催化水解，生成游離酚和磷酸鹽。酚在堿性條件下與4氨基安替比林作用，經(jīng)鐵氰化鉀氧化，生成紅色的醌衍生物，顏色深淺和酚的含量成正比。根據(jù)吸光

2、值的大小可以計算出酶的活性，也可以從標準曲線上查知酚的含量，進而算出酶活性的大小?！緦嶒灢襟E】1.底物濃度對酶促反應速度的影響(1)取6支試管，作好標記。按下表操作：（未加抑制劑組未加抑制劑組）另取6支試管，做好標記。按下表操作：（高精氨酸組高精氨酸組）管號管號試劑試劑mlml1234560.01molL0.01molL底物液底物液0.100.100.200.200.300.300.400.400.800.800.00.05mmolL5

3、mmolL高精氨酸溶液高精氨酸溶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10pH10.00.1pH10.00.1molmol碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.70蒸餾水蒸餾水1.051.050.950.950.850.850.750.750.350.351.151.1537℃37℃水浴中保溫水浴中保溫5

4、分鐘分鐘AKPAKP酶液酶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10最終底物濃度最終底物濃度(mmolL)(mmolL)0.50.51.01.01.51.52.02.04.04.00.00.0(2)加入酶液(0.05μgml)后各管混勻并立即記錄時間將上述各管置37℃水浴中準確保溫15分鐘。(3)保溫結(jié)束，立即加堿性溶液1.1ml終止反應。(4)各管分別加入0.3%4氨基安替比林1

5、.0ml，0.5%鐵氰化鉀2.0ml，充分混勻，放置10分鐘，以6號空白管作對照，于510nm波長處比色，根據(jù)酚標準曲線計算酶活性。(5)以各管基質(zhì)濃度的倒數(shù)1[S]為橫坐標，以各管吸光度值的倒數(shù)或者以酶活性單位的倒數(shù)為1V做橫坐標，作圖求出Km值。管號管號試劑試劑mlml1234560.010.01molLmolL底物液底物液0.100.100.200.200.300.300.400.400.800.800.00.0pH10.0pH1

6、0.00.10.1molLmolL碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液0.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.700.70蒸餾水蒸餾水1.101.101.001.000.900.900.800.800.400.401.201.2037℃37℃水浴中保溫水浴中保溫5分鐘分鐘AKPAKP酶液酶液0.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.100.10最終底物濃度最終底物

7、濃度(mmolL)(mmolL)0.50.51.01.01.51.52.02.04.04.00.00.00.000[Re30](0.000)0.000[Re4](0.000)0.000[Re30](0.000)0.000[Re1](0.000)0.000[Re3](0.000)0.000[Re5](0.000)0.000[Re7](0.000)Series1Linear(Series1)Linear(Series1)高精氨酸組濃度倒數(shù)1

8、S吸光度倒數(shù)1V得到擬合直線方程：y=3.4764x0.6688根據(jù)可得到：1=?11=10.6688=1.495，=3.4764=5.1983.酚標準曲線05101520253035404500.511.5Series1Linear(Series1)Linear(Series1)酚標準曲線酚含量(μg)吸光度分析：由上述圖表來看，在加入高精氨酸抑制酶活性后，酶的Km值增大，Vm值也增大【實驗討論】1.在實驗過程中，滴加試劑和反應時間的