基于血漿游離DNA濃度和完整性的肺癌非侵入性診斷價值研究.pdf

1、肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，2000年男性肺癌死亡率40.1/10萬，女性為17.2/10萬，全球每年有超過100萬名的新發(fā)肺癌患者。在我國每年因癌癥死亡的病人中有近四分之一死于肺癌。而且隨著環(huán)境污染日益加重，其發(fā)病率和死亡率有增長趨勢。因此，肺癌的防治在惡性腫瘤的防治中極為重要。實踐證明，腫瘤病人如能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，對包括肺癌在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤是非常有效的。
　　 目前臨床上肺癌的診斷方法主要有影像學

2、檢查、痰細胞學檢查、支氣管內(nèi)鏡檢查以及組織活檢。胸部x線檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)的敏感性限度是直徑1cm，此時腫瘤已較大，可能已經(jīng)侵犯支氣管上皮和血管上皮。低劑量CT檢出肺內(nèi)小結(jié)節(jié)的能力較X胸片要強的多，對周圍型肺癌檢出率也較高，然而它在小的中心結(jié)節(jié)方面則敏感性差，易出現(xiàn)漏診。痰細胞學檢查，特別是多次痰檢，對診斷起源于大氣管的中心性腫瘤是有幫助的，如鱗癌和小細胞癌。但是對于起源于小氣管的外周性腫瘤，如腺癌，特別是直徑<2cm者，其意義不大。另外，痰

3、檢篩查早期肺癌的敏感性也較低。支氣管內(nèi)鏡檢查在診斷侵襲前和早期侵襲性病變方面，可明顯提高癌前病變和原位癌的檢出率。然而，其檢查范圍也只局限與肺段口附近的支氣管黏膜而無法檢出周圍性肺癌。組織活檢有較高的靈敏度和特異度，但是它是一種極具創(chuàng)傷性的診斷方法，很難應用與肺癌病人的早期篩查。事實上，絕大部分肺癌病人被發(fā)現(xiàn)已是腫瘤晚期，臨床實踐證明，如果肺癌病人能夠在早期被診斷出，80％病人可以有一個較長的生存期。因此，肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期

4、治療是降低肺癌病死率，提高肺癌長期生存率的重要途徑。
　　 1947年Mendel等首先發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存在游離DNA，隨后許多研究人員證實了在惡性腫瘤患者血清/血漿中游離DNA含量有較正常人群增高的現(xiàn)象。循環(huán)游離DNA(CFDNA)含量增加可能與腫瘤細胞壞死和凋亡有關。腫瘤壞死過程會釋放出大量的DNA進入外周血，致使腫瘤病人血漿游離DNA含量升高。另外，腫瘤壞死過程所釋放的DNA片段一般較長，也就是DNA完整性(DIA)較好，

5、而正常人群循環(huán)游離DNA以凋亡為主，其DNA完整性較差。因此，肺癌病人的循環(huán)游離DNA含量及完整性均高于正常人群。肺癌病人循環(huán)游離DNA的這兩個特性存在潛在的診斷價值。相對于傳統(tǒng)的肺癌診斷方法的局限性(靈敏度和/或特異性低、創(chuàng)傷大)，循環(huán)游離DNA是一種無創(chuàng)或微創(chuàng)的肺癌診斷方法，因此值得深入研究。
　　 我們的研究內(nèi)容就是評價血漿游離DNA含量和完整性在肺癌診斷方面的價值。另外，有文獻報道在一些SLE病人、類風濕性關節(jié)炎病人、糖

6、尿病病人中外周循環(huán)游離DNA含量也有增加的現(xiàn)象，因此也對它們當中的DNA含量及完整性也進行了研究并分析它與腫瘤病人和正常人群血漿游離DNA含量以及完整性方面的關系。我們第一部分工作是選擇血漿游離DNA定量的方法(熒光定量PCR)，建立基因組DNA定量的標準曲線并評價評價該標準曲線的可靠性。由于CFDNA片段較短、在抽提過程易丟失、易降解。因此選擇高效的、適合血清/血漿DNA抽提的方法是CFDNA研究的關鍵因素之一，我們研究的第二部分工作

7、是對常用的四種血漿游離DNA的提取試劑盒做了比較，結(jié)果以磁珠法提取試劑盒抽提效果最好。為了便于與別的實驗室數(shù)據(jù)比較，我們對該提取方法的提取效果作了全面評價。我們的第三部分工作是采用磁珠法提取試劑盒提取肺癌組病人、其他疾病組病人(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎以及糖尿病病人)和正常組人群的血漿游離DNA，測定其中CFDNA的含量和完整性。最后采用ROC曲線分析，選取截斷值。從靈敏度、特異度、約登指數(shù)和曲線下面積幾個方面評價它們在肺癌非

8、侵入性診斷方面的價值。
　　 對于循環(huán)游離DNA的定量我們采用了國際上應用較多的熒光定量PCR的方法。我們首先提取了基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計定量后梯度稀釋成2000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、5ng/ml五個濃度作為標準品，以引物actin100和aetin400、基因組標準品為模板進行熒光PCR反應。所得到的基因組標準曲線的決定系數(shù)分別R2=0.9990，R2=0.9997；檢測范圍為

9、5～2000 ng/ml。如果每個PCR反應體系中加入血漿游離DNA模板5μl，其血漿游離DNA的最低檢測線可以達到1ng/ml。我們5次重復測量濃度為100ng/ml的樣品所得到的測量值與真實值之差最大為1.51％，平均只有0.7％；最大變異系數(shù)CV為5.61％，平均變異系數(shù)只有3.68％。說明建立的基因組DNA標準曲線的準確性和重復性均較好，能夠滿足絕對定量的需要。
　　 通過對市場上常用的微量DNA提取試盒比較，我們發(fā)現(xiàn)磁

10、珠法提取試劑盒在提取血漿游離DNA方面的效果最好。通過向血漿中投入一定量的質(zhì)粒DNA方法測得磁珠法提取試劑盒的平均提取效率為56.6％，95％的可信區(qū)間為(53.8％～59.3％)；平均相對丟失率為43.4％，95％的可信區(qū)間為(41.7％～47.1％)；平均相對抑制率為-1.67％，95％的可信區(qū)間為(-7.8％～4.4％)；提取管變異系數(shù)為5.8％。
　　 本文以巢式引物actin100和actin400中產(chǎn)物較短的acti

11、n100為引物，測得肺癌病人血漿游離DNA濃度中位數(shù)為31.36(17.86-80.22)ng/ml，其它疾病組血漿游離DNA濃度中位數(shù)為32.79(13.35-90.90)ng/ml，正常人群組血漿游離DNA濃度中位數(shù)為11.20(5.51-20.66)ng/ml.經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，肺癌病人血漿游離DNA濃度與其它疾病組血漿游離DNA濃度沒有統(tǒng)計學差異，這兩組血漿游離DNA濃度均高于正常人群組血漿游離DNA濃度。肺癌病人血漿游離DNA完整

12、性指數(shù)為0.67(0.33-0.89)，其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)為0.58(0.28-0.87)，正常人群組血漿游離DNA完整性指數(shù)為0.25(0.20-0.30)。肺癌組血漿游離DNA完整性指數(shù)大于其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)，其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)又大于正常人群組血漿游離DNA完整性指數(shù)。
　　 以循環(huán)游離DNA濃度作為肺癌診斷指標，ROC曲線分析顯示其最大約登指數(shù)為0.49，ROC曲線下面積為0

13、.805，95％可信區(qū)間為(0.764-0.845)。以循環(huán)游離DNA完整性指數(shù)作為肺癌診斷指標時最大約登指數(shù)為0.608，ROC曲線下面積為0.812，95％可信區(qū)間為(0.767-0.857)。二者相比，以游離DNA完整性指數(shù)作為肺癌診斷指標效果較好。在聯(lián)合了游離DNA濃度和完整性指數(shù)以后，其最大約登指數(shù)為0.651，ROC曲線下面積為0.873，95％可信區(qū)間為(0.836-0.909)。與單一以游離DNA濃度作為診斷診斷指標相比

14、，最大約登指數(shù)提高了32.9％，與單一以游離DNA完整性指數(shù)作為診斷診斷指標相比，最大約登指數(shù)提高了7.1％。以肺癌病人血漿游離DNA濃度為疾病診斷組，以SLE和RA合并組作為對照組，ROC曲線下面積為0.531，95％可信區(qū)間為(0.479-0.583)。以DM組作為對照組，ROC曲線下面積為0.677，95％可信區(qū)間為(0.593-0.762)。因此，循環(huán)游離DNA濃度和/或完整性指數(shù)在肺癌與其他疾病組的疾病鑒別診斷方面價值不大，需