基于血漿游離DNA濃度和完整性的肺癌非侵入性診斷價(jià)值研究.pdf

1、肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，2000年男性肺癌死亡率40.1/10萬(wàn)，女性為17.2/10萬(wàn)，全球每年有超過(guò)100萬(wàn)名的新發(fā)肺癌患者。在我國(guó)每年因癌癥死亡的病人中有近四分之一死于肺癌。而且隨著環(huán)境污染日益加重，其發(fā)病率和死亡率有增長(zhǎng)趨勢(shì)。因此，肺癌的防治在惡性腫瘤的防治中極為重要。實(shí)踐證明，腫瘤病人如能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療，對(duì)包括肺癌在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤是非常有效的。
　　 目前臨床上肺癌的診斷方法主要有影像學(xué)

2、檢查、痰細(xì)胞學(xué)檢查、支氣管內(nèi)鏡檢查以及組織活檢。胸部x線檢查發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)的敏感性限度是直徑1cm，此時(shí)腫瘤已較大，可能已經(jīng)侵犯支氣管上皮和血管上皮。低劑量CT檢出肺內(nèi)小結(jié)節(jié)的能力較X胸片要強(qiáng)的多，對(duì)周圍型肺癌檢出率也較高，然而它在小的中心結(jié)節(jié)方面則敏感性差，易出現(xiàn)漏診。痰細(xì)胞學(xué)檢查，特別是多次痰檢，對(duì)診斷起源于大氣管的中心性腫瘤是有幫助的，如鱗癌和小細(xì)胞癌。但是對(duì)于起源于小氣管的外周性腫瘤，如腺癌，特別是直徑<2cm者，其意義不大。另外，痰

3、檢篩查早期肺癌的敏感性也較低。支氣管內(nèi)鏡檢查在診斷侵襲前和早期侵襲性病變方面，可明顯提高癌前病變和原位癌的檢出率。然而，其檢查范圍也只局限與肺段口附近的支氣管黏膜而無(wú)法檢出周圍性肺癌。組織活檢有較高的靈敏度和特異度，但是它是一種極具創(chuàng)傷性的診斷方法，很難應(yīng)用與肺癌病人的早期篩查。事實(shí)上，絕大部分肺癌病人被發(fā)現(xiàn)已是腫瘤晚期，臨床實(shí)踐證明，如果肺癌病人能夠在早期被診斷出，80％病人可以有一個(gè)較長(zhǎng)的生存期。因此，肺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期

4、治療是降低肺癌病死率，提高肺癌長(zhǎng)期生存率的重要途徑。
　　 1947年Mendel等首先發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存在游離DNA，隨后許多研究人員證實(shí)了在惡性腫瘤患者血清/血漿中游離DNA含量有較正常人群增高的現(xiàn)象。循環(huán)游離DNA(CFDNA)含量增加可能與腫瘤細(xì)胞壞死和凋亡有關(guān)。腫瘤壞死過(guò)程會(huì)釋放出大量的DNA進(jìn)入外周血，致使腫瘤病人血漿游離DNA含量升高。另外，腫瘤壞死過(guò)程所釋放的DNA片段一般較長(zhǎng)，也就是DNA完整性(DIA)較好，

5、而正常人群循環(huán)游離DNA以凋亡為主，其DNA完整性較差。因此，肺癌病人的循環(huán)游離DNA含量及完整性均高于正常人群。肺癌病人循環(huán)游離DNA的這兩個(gè)特性存在潛在的診斷價(jià)值。相對(duì)于傳統(tǒng)的肺癌診斷方法的局限性(靈敏度和/或特異性低、創(chuàng)傷大)，循環(huán)游離DNA是一種無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的肺癌診斷方法，因此值得深入研究。
　　 我們的研究?jī)?nèi)容就是評(píng)價(jià)血漿游離DNA含量和完整性在肺癌診斷方面的價(jià)值。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道在一些SLE病人、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人、糖

6、尿病病人中外周循環(huán)游離DNA含量也有增加的現(xiàn)象，因此也對(duì)它們當(dāng)中的DNA含量及完整性也進(jìn)行了研究并分析它與腫瘤病人和正常人群血漿游離DNA含量以及完整性方面的關(guān)系。我們第一部分工作是選擇血漿游離DNA定量的方法(熒光定量PCR)，建立基因組DNA定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線并評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)該標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性。由于CFDNA片段較短、在抽提過(guò)程易丟失、易降解。因此選擇高效的、適合血清/血漿DNA抽提的方法是CFDNA研究的關(guān)鍵因素之一，我們研究的第二部分工作

7、是對(duì)常用的四種血漿游離DNA的提取試劑盒做了比較，結(jié)果以磁珠法提取試劑盒抽提效果最好。為了便于與別的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)比較，我們對(duì)該提取方法的提取效果作了全面評(píng)價(jià)。我們的第三部分工作是采用磁珠法提取試劑盒提取肺癌組病人、其他疾病組病人(包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及糖尿病病人)和正常組人群的血漿游離DNA，測(cè)定其中CFDNA的含量和完整性。最后采用ROC曲線分析，選取截?cái)嘀?。從靈敏度、特異度、約登指數(shù)和曲線下面積幾個(gè)方面評(píng)價(jià)它們?cè)诜伟┓?/p>

8、侵入性診斷方面的價(jià)值。
　　 對(duì)于循環(huán)游離DNA的定量我們采用了國(guó)際上應(yīng)用較多的熒光定量PCR的方法。我們首先提取了基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量后梯度稀釋成2000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、20ng/ml、5ng/ml五個(gè)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，以引物actin100和aetin400、基因組標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)。所得到的基因組標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)分別R2=0.9990，R2=0.9997；檢測(cè)范圍為

9、5～2000 ng/ml。如果每個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入血漿游離DNA模板5μl，其血漿游離DNA的最低檢測(cè)線可以達(dá)到1ng/ml。我們5次重復(fù)測(cè)量濃度為100ng/ml的樣品所得到的測(cè)量值與真實(shí)值之差最大為1.51％，平均只有0.7％；最大變異系數(shù)CV為5.61％，平均變異系數(shù)只有3.68％。說(shuō)明建立的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性和重復(fù)性均較好，能夠滿足絕對(duì)定量的需要。
　　 通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上常用的微量DNA提取試盒比較，我們發(fā)現(xiàn)磁

10、珠法提取試劑盒在提取血漿游離DNA方面的效果最好。通過(guò)向血漿中投入一定量的質(zhì)粒DNA方法測(cè)得磁珠法提取試劑盒的平均提取效率為56.6％，95％的可信區(qū)間為(53.8％～59.3％)；平均相對(duì)丟失率為43.4％，95％的可信區(qū)間為(41.7％～47.1％)；平均相對(duì)抑制率為-1.67％，95％的可信區(qū)間為(-7.8％～4.4％)；提取管變異系數(shù)為5.8％。
　　 本文以巢式引物actin100和actin400中產(chǎn)物較短的acti

11、n100為引物，測(cè)得肺癌病人血漿游離DNA濃度中位數(shù)為31.36(17.86-80.22)ng/ml，其它疾病組血漿游離DNA濃度中位數(shù)為32.79(13.35-90.90)ng/ml，正常人群組血漿游離DNA濃度中位數(shù)為11.20(5.51-20.66)ng/ml.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，肺癌病人血漿游離DNA濃度與其它疾病組血漿游離DNA濃度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這兩組血漿游離DNA濃度均高于正常人群組血漿游離DNA濃度。肺癌病人血漿游離DNA完整

12、性指數(shù)為0.67(0.33-0.89)，其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)為0.58(0.28-0.87)，正常人群組血漿游離DNA完整性指數(shù)為0.25(0.20-0.30)。肺癌組血漿游離DNA完整性指數(shù)大于其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)，其它疾病組血漿游離DNA完整性指數(shù)又大于正常人群組血漿游離DNA完整性指數(shù)。
　　 以循環(huán)游離DNA濃度作為肺癌診斷指標(biāo)，ROC曲線分析顯示其最大約登指數(shù)為0.49，ROC曲線下面積為0

13、.805，95％可信區(qū)間為(0.764-0.845)。以循環(huán)游離DNA完整性指數(shù)作為肺癌診斷指標(biāo)時(shí)最大約登指數(shù)為0.608，ROC曲線下面積為0.812，95％可信區(qū)間為(0.767-0.857)。二者相比，以游離DNA完整性指數(shù)作為肺癌診斷指標(biāo)效果較好。在聯(lián)合了游離DNA濃度和完整性指數(shù)以后，其最大約登指數(shù)為0.651，ROC曲線下面積為0.873，95％可信區(qū)間為(0.836-0.909)。與單一以游離DNA濃度作為診斷診斷指標(biāo)相比

14、，最大約登指數(shù)提高了32.9％，與單一以游離DNA完整性指數(shù)作為診斷診斷指標(biāo)相比，最大約登指數(shù)提高了7.1％。以肺癌病人血漿游離DNA濃度為疾病診斷組，以SLE和RA合并組作為對(duì)照組，ROC曲線下面積為0.531，95％可信區(qū)間為(0.479-0.583)。以DM組作為對(duì)照組，ROC曲線下面積為0.677，95％可信區(qū)間為(0.593-0.762)。因此，循環(huán)游離DNA濃度和/或完整性指數(shù)在肺癌與其他疾病組的疾病鑒別診斷方面價(jià)值不大，需